冬青苦丁茶多酚与肠道微生物相互作用及其关键互作微生物和酶的研究

Polyphenols are the important active ingredients of Kudingcha made from Ilex plants, and most of the polyphenols can reache colon in their intact forms. Thus, the interactions between polyphenols and intestinal microbiota may play crucial roles in exerting the biological activities of polyphenols. In view of the excellent basis of our research, the present project aims to study systematically the interactions between Kudingcha polyphenols (KP) and gut microbiota with the approaches such as anaerobe fermentation, proteomics and metabolomics, illuminating the relationship of interactions of KP and gut microbiota, the key microbials and enzymes, the possible mechanisms of interactions and metabolizing pathways of KP in intestinal microbials, which are quite theoretically significant. The main research contents are as follows: (1) study of the effects of KP on intestinal microbial composition and their dosage effects in anaerobe culture in vitro; (2) study of isolation and characterization of bacterial strains and enzymes to metabolize KP, eluciation of the properties of the key enzymes and their structure–activity relationship with KP; (3) study o the promoting or inhibitory effects of KP on intestinal bacterial species and their dosage effects and molecular mechanisms; (4) study of the effects of KP on mouse intestinal microbiota and metabolizing pathways in vivo.

冬青苦丁茶的主要活性成分是多酚类物质，但大部分多酚类物质以原有形式进入结肠与肠道微生物发生相互作用。因此，多酚类物质与肠道微生物的相互作用可能是其发挥生物活性的重要途径。基于我们前期良好的研究工作基础，本项目拟从体外厌氧发酵、蛋白质组学和代谢组学等方面全面系统地研究冬青苦丁茶多酚与肠道微生物之间的相互作用，代谢冬青苦丁茶多酚的关键肠道微生物及其酶，阐明冬青苦丁茶多酚对肠道菌群的调节机制和肠道菌群对多酚的代谢途径，具有重要的理论意义。主要研究内容如下：（1）研究冬青苦丁茶多酚对体外厌氧发酵肠道菌群结构的调节规律及剂量效应；（2）分离纯化代谢冬青苦丁茶多酚的肠道菌及关键酶、解析关键酶的结构及其与多酚的构效关系；（3）研究冬青苦丁茶多酚对不同肠道单菌促进或抑制作用的剂量效应和分子机制；（4）研究冬青苦丁茶多酚对小鼠肠道菌群的调节作用及其体内的代谢途径。

冬青苦丁茶是我国重要的植物饮料，含有丰富的多酚类化合物特别是咖啡酰奎尼酸类化合物（DiCQAs）。本项目系统地研究了冬青苦丁茶多酚与肠道菌群的相互作用与机制，主要研究内容与成果如下：（1）建立了冬青苦丁茶DiCQAs各单体的高效制备方法，实现了3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA三个单体化合物的同时分离制备；（2）发现冬青苦丁茶水提物和DiCQAs可以通过调节肠道菌群显著改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎；（3）通过模拟体外厌氧发酵研究了冬青苦丁茶DiCQAs对结肠炎患者肠道微生物的影响，发现DiCQAs可以显著增加结肠炎患者肠道微生物发酵体系中短链脂肪酸的产生，调节结肠炎患者肠道菌群结构（向健康志愿者菌群结构恢复的趋势）；（4）通过建立RAW 264.7巨噬细胞炎症模型研究了冬青苦丁茶DiCQAs的抗炎症活性，提出了其潜在的分子作用机制；（5）研究了冬青苦丁茶DiCQAs对高脂膳食饲养小鼠的脂代谢、炎症和肠道菌群结构的影响，发现DiCQAs可通过调节小鼠肠道菌群结构，特别是提高Akkermansia的丰度，来降低宿主机体的脂肪积累和炎症水平；（6）从人体肠道微生物中分离得到一株能够水解冬青苦丁茶DiCQAs的关键菌株（Lactobacillus fermentum LF-12），利用生物化学和分子生物学手段对L. fermentumLF-12中能水解DiCQAs的酯酶进行了分离纯化鉴定、基因序列解析、酶学特性表征和外源表达活性；（7）利用体外厌氧发酵发现肠道微生物能够分解代谢冬青苦丁茶DiCQAs，将其水解为相应的单CQAs和咖啡酸（CA），单CQAs被进一步代谢为CA和奎尼酸，CA能被转化为二氢咖啡酸等代谢产物。本项目阐明了冬青苦丁茶多酚发挥生物活性的作用机制，具有非常重要的理论意义，为冬青苦丁茶资源的深层次开发和利用奠定了理论基础。