基于宏基因组学宿主-肠道微生物互作分子靶点的发掘及其微生物源追溯（MST）研究

Clean growing water is undeniably one of the most important factors for the quality and safety of aquatic products. Unfortunately, fecal contamination of aquaculture waters from human and agricultural wastes has become a crucial and widespread problem worldwide. Consequently, a recently developed tool termed as Microbial Source Tracking (MST) has been developed to distinguish fecal pollution of different animal sources, particularly useful for non-point or multiple sources. Of which, highly accurate library-independent methods (LIM) based on quantification of host-specific genetic markers are promising. Screening and acquirement of reasonable markers for LIM is considered as the key. The goal of this work is to apply a genome fragment enrichment (GFE) method to select for genomic regions that differ among different fecal metagenomes. Functional genes involved in host-microbial interactions are screened and characterized as targets for host-specific assays. Specificity, sensitivity, cross-reactivity and detection limit are evaluated. Subsequently, the predictive models are constructed by considering the lowest number of molecular indicators needed to obtain the highest rate of identification of fecal sources in aquatic products. This work will contribute to establish a novel LIM-MST theory system based on detection of host-microbial interaction targets for fecal sources identification in our country. Moreover, it is beneficial to the management and pre-alarm system construction for aquatic products safety.

水产养殖环境对水产品质量与安全有重要影响。目前全球范围的非点源污染（主要指人类和动物的排泄物）已是导致水产品重大安全隐患的主要原因之一。微生物源示踪（或追溯）（MST）是近年来研究识别非点源污染（特别是粪便）来源的新型溯源体系，其中非依赖数据库型（LIM）无需建立数据库且精确度高而受到推崇。LIM追溯非点源污染的关键在于宿主高特异性分子标记的筛选和获得。本研究将采用宏基因组学策略靶向筛选宿主（猪）特异性分子标记，对文库分子标记进行序列和功能分析以获得适用LIM检测的宿主-微生物互作靶点，评价其灵敏度、特异性、交叉反应性及检测限，并在此基础上结合国外研究构建多因子预测模型，计算获得具有高精确度判别不同宿主污染来源的最佳分子标记组合，最终对水产品未知粪便污染来源开展MST研究。通过本项研究，有助于形成具有自主知识产权的非依赖型数据库MST体系及理论，有望为水产品安全管理和预警体系提供新思路。

粪便等非点源污染一直是威胁我国水体安全的重要因素。虽然已有关于宿主粪便微生物示踪（或追溯）（MST）的研究，但近年来关于非点源污染的形成与控制的研究仍处在初探阶段。本项目基于“肠道微生物群落与宿主共同进化”理论，主要研究及探索：（1）利用9个物种260个粪便样品DNA，通过竞争性杂交富集方法（GFE）靶向筛选参与猪-肠道微生物互作的有关特异性基因。82%的GFE富集猪源特异性非冗余序列存在相似序列，以拟杆菌群（Bacteroidetes）（43.2％）、梭菌群（Clostridia）（19.5％）蛋白相似序列为主。蛋白功能分析显示，7.6％的序列与信息贮存与加工有关，12.8％与细胞加工及信息传导有关，22％与代谢有关。（2）从编码优势菌群（Bacteroidetes、Clostridia等）信息传导有关表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代谢蛋白的相关基因中筛选26个基因片段，经宿主特异性验证发现针对1-38、2-95、2-109和3-53四条序列的引物能特异性扩增猪粪便DNA，可作为分子标记用于猪粪便污染追溯的荧光定量PCR检测方法的建立。（3）对72个猪粪样DNA及71个其他动物粪便DNA进行评价发现猪粪便特异性分子标记（1-38，2-95, 2-109, 3-53）特异性分别为93％，73%，79%， 90％，灵敏性分别为94％，88%，72%，90%。基于1-38和3-53的特异性荧光定量PCR检测方法具有较好的检测效果，具有应用于MST的潜质。（4）对浙江省及周边27个不同地区所采集64个地表水样进行猪粪便污染调查。发现猪粪便特异性分子标记（1-38，3-53）阳性检出率分别51.3％，53％，水样受猪粪便污染而非其他动物粪便污染的条件可能性分别为92.5％，91.7％，表明基于二者所建立检测方法的实际有效性；同时，E. coli O157 rfbE，Campylobacter 16S rRNA，Salmonella invA分别在70.3％，17.2％，51.5％采集水样DNA中检出阳性信号。一致性及相关性分析结果说明FIB不能指示肠道致病菌及特异性分子标记的存在，与之相比粪便特异性分子标记与肠道致病菌存在一定的相关性。因此，在水质监测时可利用特异性多分子标记组合结合潜在致病菌进行水样中猪粪便污染程度的指示。