化感水稻根际土壤关键微生物蛋白互作及其功能

采用化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont为研究对象，在本课题组前期研究化感水稻根际土壤物质组成、土壤微生物种群和土壤差异表达蛋白质的基础上，利用土壤关键微生物差异表达蛋白的编码基因构建诱饵载体，应用水稻根际土壤微生物总mRNA构建cDNA文库，通过细菌双杂交技术系统，发现和验证水稻（化感与非化感）根际土壤中微生物蛋白之间的互作关系，鉴定不同微生物蛋白的生理和生化功能，揭示关键化感微生物间互作的网络途径；以期获得水稻化感作用的关键微生物、化感物质及根系分泌物、土壤微生物与受体稗草之间的互作模式，为阐明水稻化感作用的根际生态学过程和调控机理，进一步开发水稻化感抑草菌剂，尽快实现水稻化感作用应用于生产实践提供理论依据和技术支撑。

为探讨水稻化感作用机制，明确水稻化感作用的关键微生物，了解关键微生物蛋白的相互作用，进而阐明化感水稻根际土壤微生物、根系分泌物间与伴生稗草之间的关系，建立了土壤蛋白质的提取方法和电泳图谱，建立了酚酸类化感物质、微生物群体感应信号物质AHLs的定量HPLC检测方法，建立了化感物质对羟基苯甲酸（PA）的分子印迹检测技术，实现了水稻根际分泌的化感物质动态的实时检测。在水稻土壤样品中鉴定了189个蛋白质点，其中107个来自植物，72个来自土壤微生物，10个来自土壤动物。应用LC-MS-MS检测到的72个来自土壤微生物的蛋白主要来源于变形菌门和厚壁菌门等11个菌门微生物，其主要功能涉及细胞分裂周期、细胞运动、核糖体蛋白、代谢相关蛋白、膜上蛋白、信号蛋白等。本研究建立并优化了土壤微生物总RNA提取方法，在此基础上建立了含有1000个以上单基因克隆的cDNA文库，为筛选感兴趣的目的基因，分析基因、蛋白互作奠定了基础。通过诱导表达水稻化感作用关键蛋白质OsR-1-96-B7-cam融合蛋白，将表达的蛋白免疫纯种日本大耳白兔获得多克隆抗体。运用免疫共沉淀技术（Co-Ip），捕捉了与OsR-1-96-B7-cam互作的蛋白，共得到互作蛋白11个。课题组从化感根际土壤筛选到一株化感抑草微生物（菌株A1），菌株发酵液对靶标植物莴苣的抑制率达到100％，对水稻的根长和苗高表现出显著的促进作用，IR分别为-18.2％和-18.3％；初步研究了该菌株的生长特性，优化了该菌株的培养条件，并检测分析了菌株的次生代谢物质。结果表明，该菌株最优培养条件为：温度32 ℃，摇床转速180 rpm，pH值4.5，酵母粉2％，玉米粉2％，发酵液中含有酚醌类化感物质，为进一步研究微生物次生代谢物质的化感作用提供依据；分析了外源酚酸类化感物质对水稻土壤微生物、土壤酶及养分有效性的影响，并探讨了水杨酸与DNA相互作用的电化学行为，明确了酚酸类化感物质的化感效应及其化感作用特征。