儿童恶性神经胶质瘤突变H3.3G34R/V对BS69（H3.3K36me3识别子）的功能调控研究。

H3.3 is an important histone H3 Variants. In pediatric glioblastoma multiforme, the mutation is H3.3G34R or V。BS69 is an H3.3K36me3 reader, tumor repressor. It can regulate RNA splicing through its binding to H3.3K36me3. H3.3G34R/V reduces H3.3K36me3 and therefore could disrupt BS69 binding to H3.3, and RNA splicing regulation mediated by BS69. The applicant will knock-in H3.3G34R/V into neuron stem cells using CRISPR-Cas9. We will detect the change of H3.3K36me3 and other epigenetic markers as well as the genomic location and RNA splicing of BS69. We will study how H3.3G34R/V affect the function of BS69, and provide insight into the role of BS69 in pediatric glioblastoma multiforme genesis and development.

H3.3 是组蛋白H3的重要变体形式。在儿童恶性神经胶质瘤中一个重要突变是H3.3G34突变为R或V，并伴随ATRX/DAXX和TP53的突变。 BS69是H3.3K36me3的识别子、抑癌基因，BS69能够依赖于其对H3.3K36me3的识别调节RNA剪切。由于H3.3G34R/V的突变可能影响细胞内H3.3K36me3的水平从而影响BS69正确的识别H3.3K36me3，因此H3.3G34R/V可能会影响BS69在细胞内正确行使其功能。申请人使用CRISPR-Cas9技术将H3.3G34R/V引入到正常神经干细胞内，运用自己制备的H3.3K36me3抗体，检测细胞中H3.3K36me3等重要表观遗传学参数的变化，深入探讨H3.3G34R/V是通过何种方式影响BS69的功能，揭示BS69在儿童恶性神经胶质瘤发生发展过程中的作用。

胶质母细胞瘤是比较恶性的神经胶质瘤，其5年生存期仅有不到5%，近年来，随着测序技术的发展，人们在儿童胶质母细胞瘤样本中发现了组蛋白H3.3肿瘤“驱动性突变”的存在，但是，到目前为止，对于这些突变如何驱动肿瘤发生的生物学机制尚不明确。本项目旨在探索儿童恶性神经胶质瘤的发病机理，阐明发病的分子机制。研究团队发现并证明了染色质识别蛋白RACK7（也被称为ZMYND8），而不是BS69（ZMYND11）可以在体外特异性的识别组蛋白H3.3G34R突变，同时通过基因编辑手段成功的构建了含有各种组蛋白H3.3“驱动性突变”的小鼠神经干细胞模型，以及来源于儿童胶质母细胞瘤病人的肿瘤细胞模型，并在其中证明了RACK7可以特异性的识别含有H3.3G34R突变的染色质，并通过对转录组进行分析，发现RACK7通过识别H3.3G34R突变来抑制调控主要组织特异性抗原（MHC）II复合物的产生及细胞内转运相关基因的表达，从而抑制细胞内MHC II分子表达及转运至细胞膜表面的整个过程。MHC II分子是细胞免疫重要的组成部分之一，其可以在细胞表面被CD4+ T淋巴细胞所识别，本项目的研究成果对于研究胶质母细胞瘤的免疫治疗具有重要意义。由于胶质母细胞瘤具有肿瘤干细胞的特性，本项目同时发现，在含有H3.3G34R突变的病人胶质母细胞瘤细胞模型中，敲除RACK7或者将H3.3G34R突变更正为野生型，都会导致细胞分化相关基因的表达升高，以及肿瘤细胞转移和侵袭能力的下降。作为本项目的拓展，研究团队还鉴定到H3.3G34V的识别蛋白，同时建立了荧光蛋白结合高通量体内筛选体系对其他组蛋白H3.3“驱动性突变”的识别蛋白进行筛选，并发现了一系列的调控蛋白。整个研究过程按计划进行，达到了预期的效果。总而言之，本项目阐述了组蛋白H3.3G34R突变促进肿瘤发生的潜在分子生物学机制，RACK7也可能成为含有H3.3G34R突变的这一类胶质母细胞瘤治疗的潜在靶点，对于胶质母细胞瘤的治疗具有重要的理论与实际意义。.本课题共培养了博士研究生3人，硕士研究生1人，其研究成果已投稿高水平SCI论文一篇，目前处于文章俢回状态，并尚有一篇论文正在撰写中。