蛋白质分子待定模板印迹方法研究

Herein we propose a new method termed as "pending templates molecular imprinting", in which the pending templates are of none standard or purified compounds, but the samples to be used as the studied objects. Monomer solutions are elaborately compaged to carried out "pending templates molecular imprinting" with complex protein samples as the templates. One or more abundant components with concentrations above a threshold in the sample sufficiently interact with the monomers. Thus the resulted imprinted polymer shows an affinity for these components, being able to selectively absorb them from the sample solution. After an electrophoretic or chromatographic operation on the solid phase resulted from the polymer, the sample was divided into two parts, one absorbed on the polymer and the other staying in the sample solution. By adjust the ratio of the sample and the monomer concentrations, different components can be made satisfy the threshold, then the sample can be cut into a series of portions with various and controllable complexities. This greatly reduces the complexity of the original sample. Conclusively the adjustable affinity between the polymer and the sample (component) plays an important in protein separation. After thoroughly examining the extraction, separation, concentration and enrichment effects of the polymers, chromatographic and/or electrophoretic columns are fabricated to accelerate the research and popularization of secondary generation and further imprinting. Finally an "onion shelling" protocol for protein biomarker discovery can be practically established.

提出"待定模板印迹"新方法，其中模板分子具有可调性，它们不是任何已知标准品或纯化物质，而是辄需研究的复杂样品混合物本身。精心选配多种单体，以复杂蛋白质样品作为模板，实施蛋白质分子印迹。样品中浓度超过一定"阈值"的一种或多种高丰度组分与单体充分作用，导致合成的印迹聚合物对其具有亲和性，能够从溶液中特异性地吸附这些组分。由印迹聚合物制备固定相，经过色谱或电泳操作，将样品组分分成两部分，一部分吸附在聚合物上，一部分留在溶液当中。通过调节样品与单体的比例，让不同组分达到浓度阈值，可将样品分割成复杂程度不同的两部分，可以显著地降低原样品的复杂性。聚合物与组分的这种可调控的亲和性在蛋白质分离分析中发挥重要作用。通过考察聚合物的萃取、分离、富集、浓缩效应，制备出色谱、毛细管电泳分离柱，促进待定模板印迹分离、分析方法研究，实现次级、多级样品印迹，据此发展"剥洋葱"式蛋白质分子标记物发现方法。

常规印迹体系中，单体、模板分子均被溶剂包围，降低了它们相互作用的机会。在冰冻聚合过程中，大部分溶剂（水）分子发生固化排除溶质，并对余下液体进行挤压，使得单体、模板浓度增加，从而强化了其间的相互作用。冰胶具有超大孔结构，传质阻力小，另外聚合物易于改性，是研究分子相互作用的上选材料。同一配方的单体溶液，可合成出对不同蛋白质均有印迹效果的聚合物，说明“待定模板印迹法”具有广泛的适应性，有利于处理复杂生物样品如血清中成千上万不同浓度的蛋白质。. 复杂样品的印迹过程中，浓度高于某阈值的蛋白质都能在聚合物中形成自身的识别位点，从而可被选择吸附，而低丰度蛋白质则留在溶液当中，样品因此分为两个相对简单的次级样品。对次级样品重复上述处理，可以大幅降低其复杂性，理论上可以发现任何存在的低丰度蛋白质。人血清样品研究发现491种蛋白质，其中94种只在原始样品发现，而75种只出现在冰胶处理过的样品中。不但实现了高丰度组分的明显去除，而且富集了低丰度蛋白质。与人血清样品类似，牛血清蛋白质的印迹实验表明，脱除高丰度蛋白质与富集低丰度蛋白质也可同时完成。. 在蛋白质—印迹聚合物体系中，氢键、亲水、疏水相互作用普遍存在并构建多重识别位点。相对来说，静电作用具有更高的键能，少量引入即可有效调节基质与模板之间的作用强度。丙烯酸、烯丙基胺类单体的改性均能增强聚丙烯酰胺冰胶对蛋白质的亲和力，其中的氨基、羧基并非均匀、对称地分布，而是集中在印迹空穴内表面。理论上，氨基、羧基应该与蛋白质表面电荷呈互补的对应关系：聚合物氨基对应蛋白质羧基、聚合物羧基对应蛋白质氨基。. 另外，改性聚丙烯酰胺冰胶既能作为催化剂，也能用于疏水化合物（雌二醇、酞酸酯）的印迹。假以时日，“待定模板印迹法”必将在以下方面发挥重大作用：（1）高丰度蛋白质的脱除，(2) 差异蛋白质组学研究，(3) 从复杂样品中获取人源（或其他）蛋白质，（4）高灵敏度、高选择性传感器研发。