携带神经特异MicroRNA靶序列的重组寨卡减毒株的设计与免疫保护机制研究

The global spread of Zika virus (ZIKV) and unexpected link to birth defect urge study of ZIKV pathogenesis and the rapid development of a safe and effect vaccine. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small, non-coding RNAs that play a pivotal role in the regulation of posttranscriptional gene expression in eukaryotic organisms. In previous studies, we found that ZIKV replicated efficiently in the mouse embryonic brain by mainly targeting neural progenitor cells and caused microcephaly. In this study, by using RNA-seq, microarray analysis and Northern blot we will characterize the miRNA production pattern in ZIKV-infected neural cells including neural progenitor cells, human embryonic stem cells and neurons. A set of miRNAs with highly expression in these cells will be identified. Next, we will insert neural specific miRNAs target sites into ZIKV genome by using reverse genetics to generate recombinant ZIKVs (miRNA-ZV), and determine their replicative properties in neural and non-neural cells. Further, the tissue tropism of miRNA-ZVs will be explored in mice, and protective efficiency of miRNA-ZVs will be evaluated in the mouse model of ZIKV infection. Our study will identify a set of miRNAs close related with ZIKV infection in neural cell lines, and elucidate the underlying mechanism responsible for miRNA-mediated attenuation of the miRNA-ZIKV. The findings in our study will provide insights into understanding ZIKV-host interactions. The live attenuated neurovirulence miRNA-ZV will deserve further development as a ZIKV vaccine candidate.

寨卡病毒因与小头症密切关联而备受关注，阐明其独特的致病机制和研发疫苗迫在眉睫。MicroRNA（miRNA）是一类组织特异性表达的具有重要调控功能的非编码小RNA。我们的前期研究发现，寨卡病毒能靶向胎鼠神经祖细胞和胶质细胞，导致皮层发育异常和小头畸形。本研究首先通过深度测序分析寨卡感染神经祖细胞、胶质细胞及胎脑中miRNA表达谱特征，鉴定特异细胞中高丰度表达的miRNA及其潜在功能；同时利用建立的寨卡病毒反向遗传学技术平台，构建一系列携带脑组织特异miRNA 靶序列的重组寨卡病毒，系统评估其体外复制能力，筛选丧失神经毒力显著降低的减毒株，进一步评价其在动物体内导致的细胞和体液免疫反应水平，并完成其对寨卡攻击的免疫保护效果评价。本研究将能够鉴定出与寨卡病毒神经嗜性密切相关的miRNA，获得神经毒力显著降低的重组寨卡减毒疫苗株，对于深刻理解寨卡病毒与宿主相互作用及新型疫苗研发具有重要意义。

2015年南美暴发的寨卡病毒可导致以小头症为代表的先天性寨卡综合征，严重威胁人类健康，研发安全有效的寨卡病毒疫苗刻不容缓。MicroRNA（miRNA）是一类组织特异性表达的非编码小RNA，在调控细胞增殖、细胞分化和个体发育等过程中发挥重要作用。通过病毒基因工程手段将组织特异性的miRNA靶序列插入病毒基因组后，有望限制突变病毒在表达该miRNA的特异组织中的复制，进而降低或去除病毒的感染和致病能力，是一种具有前景的靶向减毒策略。为此，本研究首先通过深度测序分析寨卡病毒感染神经祖细胞、胶质细胞及胎脑中miRNA表达谱特征，鉴定特异细胞中高丰度表达的miRNA；进一步利用建立的寨卡病毒反向遗传学技术平台，构建了一系列携带脑组织特异miRNA靶序列的重组寨卡病毒，系统评估了其体外复制能力，筛选获得了神经毒力靶向降低的减毒株，并评价其在动物体内的免疫保护效果。本项目发现了与寨卡感染密切相关的脑组织特异miRNA，获得6株减毒特征明确的携带脑组织特异miRNA靶序列的重组寨卡病毒株，完成了1株重组病毒（miRNA-124*3）的免疫保护效果评价。本研究建立了miRNA靶向减毒重组黄病毒设计与评价系列技术，成功实现了寨卡病毒的神经靶向减毒，并获得了能够有效阻断病毒感染和垂直传播的重组寨卡减毒疫苗候选株。上述研究结果加深了我们对寨卡病毒与宿主神经系统相互作用的认识，为利用miRNA靶向减毒策略开发设计虫媒黄病毒减毒疫苗提供了技术储备。