西尼罗病毒非结构蛋白NS3对病毒RNA复制的调控机制研究

西尼罗病毒基因组为单股正链RNA，非结构蛋白NS5具有RdRp活性，负责病毒RNA的复制。在前期工作中，我们发现非结构蛋白NS3能促进NS5与病毒RNA的结合，很可能参与了病毒RNA的复制过程。为此，本研究拟首先建立NS5的RdRp活性分析系统，在体外观察NS3对NS5聚合酶活性的影响；进而通过突变分析、EMSA、GST pull-down和免疫共沉淀等方法，确定NS3中与NS5相互作用的关键区域和位点；在此基础上，将NS3突变引入复制子和感染性克隆，通过激光共聚焦等法观察NS3突变对NS5时空分布的影响，借助复制子和实时定量RT-PCR等方法分析病毒RNA的复制情况，比较恢复病毒的空斑形态、一步生长曲线和动物致病性等生物学特征，明确上述NS3突变对病毒复制的影响。本研究将能够初步阐明西尼罗病毒NS3对病毒RNA复制的调控机制，加深对虫媒黄病毒复制机理的认识，为发现新的抗病毒靶点奠定基础。

本项目的研究计划包括建立西尼罗病毒（WNV）非结构蛋白NS5 的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp） 活性分析系统，在体外观察非结构蛋白NS3 对NS5 RdRp活性的影响，确定NS3 蛋白内部与NS5 蛋白相互作用的关键位点；采用反向遗传学技术在复制子水平和病毒水平分析其功能。本项目按计划开展了研究工作，取得了如下重要的研究结果：（1）建立了稳定的体外RdRp活性分析系统，明确了WNV的NS3蛋白是通过结合NS5蛋白的非RdRp区发挥调控作用。利用原核表达系统获得了具有完整RNA解旋酶活性的重组NS3蛋白，进一步通过体外RdRp活性分析系统发现，NS3蛋白能够降低病毒基因组5′-非编码区第28、37、38和43位及第8和9位核苷酸突变对NS5蛋白RdRp活性的影响，同时还发现NS3蛋白对完整的NS5蛋白RdRp活性的影响更为显著，表明NS3可能通过结合NS5的非RdRp区域发挥其调控作用。（2）获得了能够有效表达外源报告基因的WNV复制子。将eGFP和Rluc报告基因替换WNV结构基因后，获得了含有CMV启动子的DNA形式的复制子pWNrep/eGFP 和pWNrep/Rluc。通过荧光检测和酶活性分析发现，该复制子能够有效表达外源基因，具有良好的复制活性。(3)完成了NS3和NS5蛋白之间潜在相互作用位点的结构信息学分析。将黄病毒的NS3编码区进行了序列比对，深入分析了NS3蛋白的NTP酶/RNA解旋酶和NS5蛋白的晶体结构信息，将NS3蛋白中构成ATP结合袋的2个解旋酶2类超家族的motif作为研究对象，选取motif I中的G199，K200和T201和motif VI中的Q457，R458，R461和R464为突变靶点，目前正在通过突变分析检测NS3蛋白的解旋酶活性，以及与NS5的结合能力。在本项目的资助下，共发表SCI论文3篇，中文核心期刊论文1篇。在项目实施过程中，项目负责人的科研能力得到了充分的锻炼，研究水平也得到了很大提高。目前担任微生物流行病研究所病毒学研究室虫媒病毒课题组组长。项目负责人取得的研究成果也受到国内外同行的认可，并受邀参加了2011年第九届全国病毒学学术研讨会，获得Poster一等奖；此外，还有幸受邀在2012年第六届国际疫苗学会全球年会做大会报告。此外，本项目还资助了2名硕士（已于2011年获硕士学位）和1名博士研究生。