乙脑病毒基因组内部假结（NS2AIn-PK）调控I型干扰素反应的作用机制

Japanese encephalitis virus (JEV) infection in mammal cells rapidly triggers type I interferon (IFN) response , which was regulated by either viral proteins and/or untranslated regions of viral genome. In previous studies, we identified a highly conserved RNA pseudoknot within the NS2A gene (NS2AIn-PK) of JEV. Destruction of the pseudoknot resulted in significant increase in IFN production in JEV-infected cells, suggesting potential biological function of NS2AIn-PK during virus infection. In this proposal, in vitro synthesized RNA transcripts covering JEV genome will be transfected into A549 cells to identify the critical RNA motifs which was responsible for IFN induction. Then nucleotides critical for stability of the pseudoknot will be determined based on RNA secondary structure prediction and RNase digestion assay, followed by evaluation of the ability of pseudoknot mutants to stimulate the production of IFN. Furthermore, EMSA, WB and IFA will be performed to clarify the interaction of the pseudoknot and important factors involved in RIG-I signal pathway. Finally, using site-specific mutagenesis and reverse genetics technology, we will evaluate different levels of innate immune signaling and response induced by the pseudoknot defective mutant viruses in vivo. Our project will identify a novel pseudoknot-dependent PAMP of JEV and clarify the molecular mechanism of trigger innate immune response. This project will contribute to the understanding of complex mechanism of JEV evasion from innate immune response of host.

乙脑病毒感染宿主细胞后迅速激活宿主的I型干扰素反应，病毒蛋白或基因组非编码区可通过不同的机制调控宿主的干扰素反应。最近，我们发现乙脑病毒基因组内部存在一个保守的RNA假结结构，破坏该结构能显著增强其诱导干扰素产生的能力，可能具有重要的生物学功能。据此，本研究首先通过体外转录合成和截短分析的方法，评估乙脑病毒基因组不同区段RNA刺激干扰素产生的能力；结合RNA二级结构预测和核酸酶试验确认影响假结结构稳定性的关键位点/区域，利用突变分析观察假结结构变化对其刺激产生干扰素能力的影响；进而通过一系列生化分析方法明确假结与RIG-I及其下游信号分子的相互作用，确定其拮抗干扰素产生的作用机制；最后，通过反向遗传学技术构建假结缺陷型病毒，观察其在体内的生物学效应。本研究将能够发现病毒利用基因组内部的RNA结构调控宿主干扰素反应的独特机制，有助于深刻理解病毒与宿主天然免疫系统之间复杂的相互作用。

在本课题经费的支持下，一方面我们根据课题设立的研究内容开展研究，对乙脑病毒基因组RNA 中的不同区段调控干扰素信号通路的能力进行了系统分析，发现了多个重要的调控元件；同时还在乙脑基因组的非编码区发现了潜在的外源干扰素刺激元件插入位点，构建并成功拯救了多株携带外源干扰素刺激元件的突变病毒。上述研究工作一方面为干扰素调控的致弱型乙脑病毒的定向改造提供了重要靶标，同时也为基于乙脑减毒株载体的重组干扰素激活剂的设计提供了新方案。. 另一方面，紧密围绕“虫媒黄病毒致病机制与新型疫苗设计”开展研究，取得一系列重要的研究发现：1）分离获得我国第一株寨卡病毒，为我国启动寨卡相关研究奠定了重要的物质基础；在国际上率先建立了寨卡病毒的垂直传播感染模型，为寨卡病毒与小头症之间的联系提供了直接的实验证据；建立了我国第一个寨卡病毒猴体感染模型，为抗病毒药物和疫苗评价铺平了道路；国际上首次构建成功嵌合型寨卡减毒活疫苗候选株，为寨卡病毒的预防提供了新的手段。上述成果发表在国际知名期刊Lancet Infect Dis 、Cell Res 、Nature Communications 和EBioMedicine，受到N Engl J Med、Nature 等期刊综述的评述，产生了重要的学术和社会影响。2）建立了神经嗜性黄病毒的的小鼠感染模型，实时再现了干扰素控制病毒感染的过程。相关研究发表在Theronostics。该研究为系统研究嗜神经黄病毒致病机制，发现新的潜在的靶器官提供了新的研究工具。3）首次证实我国新分离的坦布苏黄病毒对人的感染致病性风险较低。我们利用干扰素受体敲除小鼠和恒河猴，首次证实新发坦布苏病毒无法在猴体内建立感染，哺乳动物的干扰素系统可有效控制该病毒的增殖，相关研究发表在病毒学权威期刊J Virol。基于该实验证据，我们认为，新发坦布苏病毒仍然是一种感染禽类的黄病毒，其感染人类并致病的风险较低，消除了公众对该病毒感染人的顾虑。