Ⅳ型胶原-DDR1-MMP9通路在脑缺血再灌注损伤引起的血脑屏障破坏中的作用及机制

我们发现脑缺血再灌注损伤上调基质金属蛋白酶9 (MMP9)表达，引起血脑屏障（BBB）破坏。阻断MMP9过表达将有效减轻脑缺血再灌注引起的BBB破坏。但调控MMP9表达的分子机制尚不清楚。MMP9过表达可降解BBB基底膜的Ⅳ型胶原并导致其部分脱落。盘状结构域受体1(DDR1)是细胞膜表面受体型酪氨酸激酶，它可与基底膜上脱落的Ⅳ型胶原结合后被活化。我们预实验发现脑缺血再灌注后DDR1活化，且活化的DDR1又可调控MMP9表达。因此，我们推测Ⅳ型胶原-DDR1-MMP9通路在脑缺血再灌注引起的BBB损伤起重要作用。本课题综合利用腺病毒过表达系统、报告基因系统、RNAi、抗体亲和沉淀结合质谱等技术，系统验证脑缺血再灌注损伤中IV型胶原-DDR1-MMP9环路的存在，并初步阐明DDR1调控MMP9表达的分子机制，为脑缺血再灌注后BBB损伤机制提出新的认识，并为发现新的药物作用靶位提供线索。

DDR1属于圆盘状结构域受体型酪氨酸激酶，主要由胞外区、跨膜区和胞内激酶区三部分构成，胞内激酶区可发生酪氨酸磷酸化。正常情况下，DDR1主要表达于肺、肾、结肠和脑组织的内皮细胞。以往诸多肿瘤研究中已证实DDR1可通过与各型胶原的结合介导MMP9表达的上调和活性的增加，在肿瘤细胞的转移和扩散中起着重要的作用。当脑缺血性或外伤性损伤后，MMP9的表达明显增加，MMP9主要作用于血脑屏障基底膜而起破坏作用。但是DDR1和MMP9的关系在中枢神经系统的研究较少，而在脑缺血损伤后并未见报道。.本研究验证DDR1-MMP9通路在脑缺血BBB损伤中作用，并初步阐明DDR1介导MMP9表达的分子机制。本研究最主要研究结果如下：①应用免疫荧光和免疫印迹分析证实MCAO模型后DDR1表达增高，DDR1-siRNA可降低表达，并减轻脑损伤、减轻血脑屏障破坏。②MCAO后DDR1的磷酸化水平在24h达到高峰，MMP9的表达也有类似趋势。③采用氧糖剥夺模型，证实DDR1主要在神经元而非神经胶质细胞表达。给予Ⅳ型胶原刺激可在6h使DDR1表达增至顶峰。④检测DDR1磷酸化对MMP9 mRNA转录和蛋白表达以及酶活性的影响，通过Real-time PCR、Western blot和酶谱分析显示，以Ⅳ型胶原刺激DDR1磷酸化，可促进MMP9 mRNA转录和蛋白表达，提高MMP9的酶活性。利用双荧光素酶报告基因系统检测了DDR1表达水平对MMP9启动子活性的影响，结果显示，DDR1的水平与MMP9启动子转录活性呈正相关。⑤免疫沉淀结合SDS-PAGE电泳分离鉴定DDR1相互作用蛋白，显示胶原刺激DDR1活化后亲和力显著增强的相互作用蛋白有两条，分别位于55KD和43KD附近。.综上所述，本研究一方面系统验证脑缺血损伤中IV型胶原-DDR1-MMP9环路的存在，另一方面初步阐明DDR1调控MMP9表达的分子机制，为脑缺血再灌注后BBB损伤机制提出新的认识，并为发现新的药物作用靶位提供线索。本研究取得的成果如下：发表SCI论文1篇（Neurosci Lett），另有1篇在投；发表核心期刊论文4篇（2篇刊出，2篇待刊出），获得新型实用专利1项，培养硕士研究生3名。