乙肝病毒在核苷（酸）类药物抗病毒治疗过程中的微进化

Hepatitis B Virus (HBV) is a DNA virus with high frequency of mutations during replication. Along with the course of nucleos(t)ide analog-based anti-viral chemotherapy for patients with chronic Hepatitis B, rapid emergence of drug-resistant mutations in the HBV genome may finally lead to treatment failure (virological breakthrough), which is an ideal model for the study of fast viral microevolution under the selective environmental pressure. Series of individual patients’ serum samples have been collected at different time points in a follow-up clinical study subjected to the treatment of nucleos(t)ide analogs, such as Telbivudine (Ldt). Second generation sequencing technology will be used to deep sequence the HBV populations of individual patients. This study will identify low proportion of genetic variations and the dynamics of genetic variations in the whole spectra HBV genome along the course of treatment. The genetic effects of mutations in the overlapped genes and their possible associations with the viral biological fitness and drug-resistant implications will be further elucidated. The molecular mechanism of HBV drug-resistance microevolution will thus be studied employing a time-series in vivo population genetic data for the first time. The dynamics of niche adaptation of HBV genome under anti-viral chemotherapy pressure will be portrayed via analyzing the time-series variations of HBV gene-sequences versus the dynamics of viral titers in patients’ serum samples. This study not only will reveal the molecular mechanism of HBV evolution under the selection pressure of nucleos(t)ide analog treatment, but also will provide new clues for resolving clinical difficulties in dealing with drug-resistance cases, including proper biomarkers for early detection of drug-resistance.

乙型肝炎病毒（HBV）是一种突变率较高的DNA病毒，在核苷（酸）类似物药物的作用下，HBV基因组会快速进化，产生抗药性，提供了一个生物在新环境选择压力下快速适应的经典的微进化案例。本课题以我国常用的此类药物，如替比夫定（LdT）治疗慢性乙型肝炎过程中，一系列时间点采集的血清样本为研究材料，运用高通量测序手段获取HBV基因组的深度测序序列数据；进而在患者个体水平描绘包含低丰度突变组分的病毒群体变异谱，了解HBV相互重叠的各基因之间的相互作用和影响，探索这些突变在基因产物交互作用影响下的生物学意义。通过研究治疗过程中HBV基因序列变化规律和携带不同突变的病毒数量与时间序列之间的动态关系，在病人个体水平揭示HBV在药物选择压力下发生适应性变异的动态过程。本研究将深刻解析HBV适应药物选择压力的进化机理，为解决临床耐药问题提供了新的思路，并为耐药的早期检测提供可靠的分子标记。

耐药的产生是病毒基因组快速进化以适应药物选择压力的结果。本项目通过对核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗过程中乙型肝炎病毒（HBV）基因组动态演化的研究，探讨了药物选择压力下病毒的微进化模式和规律。首先，我们选取了服用替比夫定（LdT）进行抗HBV治疗患者在不同时间点的血清样本共107份，针对NAs作用的靶基因RT基因进行了深度测序和分析，发现携带关键耐药位点突变的rtA181T准种与rtM204I准种在种系发生上是各自独立的事件，这两个关键位点突变频率的动态演化与药物疗效密切相关；还建立了微分方程模型，模拟携带不同突变的准种与野生型准种之间的相互协作与竞争关系；揭示了药物选择压力下HBV野生型准种与耐药准种之间、以及携带不同耐药突变的准种之间基因序列变化规律及相关病毒在用药时程上的竞争与协作，以维持种群在抗病毒药物选择压力下生存的定量动态关系。在此基础上，我们进一步开展了S基因在LdT治疗过程中的微进化及其与RT基因协同作用的研究，发现S基因若干位点的变异与病毒对药物的应答效果相关，病毒群体S基因异质性的下降与良好的病毒学应答相关，提示S基因与RT基因协同作用，通过针对药物和/或宿主免疫系统的适应性变异维持病毒种群在药物选择压力下的生存。我们还利用高精度的环化测序技术，并开发了极低频率突变识别的算法，在更精细的尺度下考察S基因与RT基因微进化关系。我们发现在测序区域内，几乎每一个氨基酸都可能发生同义突变或非同义突变，某一位点的碱基突变在RT基因更倾向于导致氨基酸的同义突变，而在S基因更倾向于导致非同义突变。最后，通过对HBV进行全基因组深度测序，我们发现除了RT和S基因，病毒基因组上的其他基因也通过一定的演化模式参与了NAs作用下的病毒微进化，提示在HBV通过基因突变“重塑”基因组以获得耐药表型的过程中，存在着多基因的相互作用。本项目的研究揭示了药物选择压力下HBV基因组的微进化过程和规律，为深入探索病毒基因组适应性变异的基本机制奠定了基础，并为解决临床耐药问题提供了新的思路和理论支持。