利用基因敲除小鼠研究NRAGE在骨代谢稳态中的功能

骨代谢紊乱会导致以骨质疏松为代表的多种骨代谢疾病的产生。骨发育相关分子，尤其是影响成体骨量的分子因其易成为治疗靶标而备受关注。基于基因敲除小鼠模型，我们前期研究发现，NRAGE基因敲除对胚胎期骨骼发育没有影响，但是成体小鼠骨量明显下降，骨超微结构发生退行性改变，体外破骨细胞的分化能力明显增强。这些重要结果提示：NRAGE可能是一个新的成体骨代谢稳态的调控分子。本项目以基因敲除小鼠为模型，拟通过激素水平和钙磷沉积的检测、成骨细胞和破骨细胞功能的分析、骨代谢相关信号通路的探讨，从动物整体、细胞和分子水平较为系统地揭示NRAGE在骨代谢调控和骨稳态维持中的生理功能，初步探讨该基因在骨质疏松中的作用，希冀能够为以骨质疏松为代表的骨代谢疾病的防治提供新思路。

骨代谢紊乱会导致以骨质疏松为代表的多种骨代谢疾病的产生。骨发育/代谢相关分子，尤其是影响成体骨量的分子因其易成为治疗靶标而备受关注。因骨发育/代谢相关基因在人类和小鼠中极为保守，所以遗传工程小鼠可作为研究骨代谢机制的理想模型。本项目正是基于基因敲除小鼠，发现了一个新的骨代谢稳态调控基因—NRAGE (neurotrophin receptor–interacting MAGE homolog)。做为细胞内重要的接头分子，NRAGE已被证明可通过与不同蛋白的结合而参与调控机体多种生理病理过程，但该基因与骨代谢的关系尚未有任何报道。本项目中，我们发现NRAGE基因对胚胎期骨骼发育并没有影响，但可显著影响成体骨代谢稳态的维持。综合运用多种实验方法，我们全面分析了NRAGE基因敲除小鼠骨代谢表型，发现该基因的敲除导致骨密度显著下降、骨超微结构发生明显退行性改变，骨生物力学性能下降，确证该基因的敲除导致小鼠出现骨质疏松症状。进一步机制研究发现，NRAGE基因的缺失并不影响小鼠钙磷代谢水平，但可明显提高成骨细胞和破骨细胞的功能。就破骨细胞而言，该基因的敲除不影响其凋亡能力，但明显促进破骨细胞的分化能力和骨吸收活性。Western blot、荧光素酶报告基因和qPCR一致表明，NRAGE敲除导致破骨细胞分化能力的提高与NF-κB信号通路的激活相关。在成骨细胞方面，体内钙黄绿素双标实验和体外细胞培养实验显示，该基因缺失对成骨细胞凋亡能力没有影响，但可显著提高其增殖和分化能力。表达谱数据和qPCR结果推测，wnt信号通路及其相关组分可能参与调控了敲除型成骨细胞的分化增强过程。成骨细胞和破骨细胞之间的耦联平衡对骨代谢稳态的维持至关重要。共培养实验和qPCR数据显示，NRAGE基因缺失的成骨细胞可通过提高RANKL/OPG比例和增强炎性因子分泌进而提高破骨细胞的活性。综上所述，NRAGE基因敲除后，成骨细胞和破骨细胞功能均得以提高，但破骨细胞的激活作用受其自身和成骨细胞的双重调节，最终骨吸收大于骨形成，敲除小鼠表现为高转换型骨质疏松。. 本项目研究成果不仅拓宽了我们对NRAGE基因功能的认识，而且能更好的阐明以骨质疏松为代表的骨代谢疾病的发病机理，为其防治提供新思路。