阿维菌素高产相关基因的解析与优化

阿维菌素是由阿维链霉菌产生的广谱杀虫抗生素。申请人在前期研究中，通过诱变育种及高通量筛选获得了一株可稳定遗传的高产突变株，其产量达到出发菌株的50倍以上，在工业生产中阿维菌素B1a效价达到6000 μg/mL以上。为解析其高产机制，我们对该菌株进行了全基因组测序及分析。本项目拟通过基因组序列、基因芯片杂交、代谢产量参数和蛋白表达谱关联分析，研究该菌株与与原始出发菌株的差异；找到可能影响阿维菌素产量的关键基因；通过对关键基因进行过量表达或删除的方法来研究该基因的功能；用分子外DNA杂交、易错PCR等方法建立突变文库，转化宿主菌，经高通量筛选获得发酵性状变化明显的突变株并进行基因片段测序，解析基因序列变化与发酵性状变化的关系，将系统生物学、生物技术和产品有机结合，深入阐明阿维菌素生物合成中高产相关基因的功能，为全面解析阿维菌素高产机制奠定基础，为进一步优化阿维菌素的生物合成过程提供理论依据。

阿维菌素是农业和畜牧业领域广泛应用的低毒广谱杀虫剂，最新研究发现其具有抗菌、抗肿瘤和抗结核菌活性，是唯一年产值达到30亿元的生物农药。该微生物天然产物结构复杂、产量较低，本实验室前期通过传统的菌种优化方法获得了阿维菌素产量大幅度提高的系列高产菌株，然而其高产机制不明确，极大地限制了后期进一步产量提高的可行性。本项目通过合成生物学方法对阿维菌素高产菌的基因组和转录组数据进行挖掘，找到其中引起阿维菌素高产的部分可能原因，并在这些信息的指导下，通过对工业菌株进行改造使得产量进一步提高。此外，我们对前体代谢、调控因子和次级代谢的分析和研究，也为后期通过合成生物学进一步优化阿维菌素高产模型，重构阿维菌素高产菌株提供了合适的底盘，元件和装置。通过比较基因组学研究发现，高产菌株含有2个拷贝的阿维菌素生物合成基因簇，本项目进一步对阿维菌素生物合成基因簇进行深入研究，通过合成生物学手段成功钓取阿维菌素生物合成基因簇中的聚酮合酶aveA1，改造并构建了该酶的异源表达载体，用不同方法检测了蛋白的表达情况；同时也将全簇在异源宿主中进行了表达。研究中获得的有功能的生物合成元件为进一步改造高产菌株，研究异源模块与底盘细胞之间的适配性提供良好的素材。阿维链霉菌的发酵产物中含有8种组分的阿维菌素，分别为A1a，A2a，B1a，B2a，A1b，A2b，B1b和B2b，其中B1a为最有效组分。本项目采用代谢工程的研究手段结合合成生物学的方法，研究前体代谢对阿维菌素产量以及a、b组分比例的影响，同时以一系列高产菌为研究对象，对其高产机制进行了初步的解析，获得了阿维菌素有效组分大幅度提高的菌株，为后续进一步通过理性改造而提高阿维菌素产量提供依据，也为其它微生物次级代谢产物产量的提高提供了例证。本项目优化获得的阿维菌素高产菌株，在合作企业进行了推广应用。通过进一步优化发酵过程控制参数、改进设备等，实现了阿维菌素的高效生物合成。在120~550 立方米发酵罐中，提高了阿维菌素B1a的产量至9g/L以上，生产效率较国际上阿维菌素发酵水平最高的美国默克公司提高60%以上。该成果通过中国科学院评审，被推荐申报2016年度国家科技进步一等奖。