一种海洋微生物来源的新型琼胶酶的作用机制研究

海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高值化的关键技术之一。本项目针对国内外在海洋微生物来源的多糖降解酶及其酶解机制研究方面的不足，以及耐高温新型琼胶酶的潜在应用价值，利用课题组已完成国家基金项目等资助获得的一种海洋微生物X3来源的耐高温、新型琼胶酶agaXa等系列成果基础上，集多学科优势力量，引入先进、成熟的化学手段和现代生物学技术，实现琼胶酶agaXa基因的高效原核表达、高质量重组酶的纯化，进一步研究其酶学性质、降解琼胶的产物分析和裂解琼脂糖的方式，并定位琼胶酶的活性结构功能域以及寻找影响酶活和热稳定性的关键氨基酸，构建酶活缺失突变体。然后，研究琼胶酶agaXa及其突变体的变构温度以及在热变性过程中构象变化，揭示琼胶酶结构与功能的关系；从纳米水平上观察琼胶酶与琼脂糖作用的构象，揭示琼胶酶与底物识别的机理。所获结果将为最终揭示琼胶酶agaXa的作用机制奠定基础。

本项目针对国内外在海洋微生物来源的多糖降解酶及其作用机制研究方面的不足，以及耐高温新型琼胶酶的潜在应用价值，成功地构建了一种来源于海洋微生物Catenovulum sp.X3的耐高温、新型琼胶酶agaXa的重组表达工程菌，实现了琼胶酶agaXa 基因的高效原核表达、高质量重组酶的纯化，研究了agaXa酶学性质及其作用机制。研究发现琼胶酶agaXa在温度37-55℃以及pH6.2-8.0具有较高的酶活力，其中在温度55℃、pH7.4时酶活力最高，Na+、K+、Ca2+、Mg2+等金属离子以及β-Met 和DDT可以增加AgaXa的活力，其中DDT对其酶活的促进作用最为明显，有机溶剂30%的丙酮使酶活力可以提高84%。Mg2+能部分增强酶稳定性，而Al3+、Fe 3+、Co2+、Ni2+却可以显著降低其稳定性。agaXa在室温放置 150天后仍很稳定。agaXa降解琼脂糖的Km，Vmax，Kcat及Kcat/Km 值分别为10.5 mg/mL，588.2 U/mg，5.15×102 s−1及 4.9×106 s−1 M−1。agaXa降解琼脂糖的终产物为新琼寡糖，主要是新琼八糖和新琼十糖，还有少量的新琼六糖和新琼十二糖，因此agaXa是β–琼胶酶。通过构建突变文库结合定点突变确定了Val197、Ile217、Pro259、Cys442、Cys528等五个氨基酸对酶活力与热稳定性有着关键性的作用，且Val197、Pro259、Cys442、Cys528会引起构象的改变。IUPred和RONN的分析预测表明在agaXa的N端和C端存在无序区域，酶活缺失的截短突变体AgaXa-N110和AgaXa-C513可以准确识别并绑定到琼脂糖之上，表明agaXa识别底物的CBM位于其中间部位而与催化活性相关的氨基酸位于两端的无序区域。通过圆二色谱分析，证实β-折叠的高含量是agaXa耐热性的主要原因，而无序区域在高温下的减少或向β-折叠的转变都会导致酶活的降低，同时二硫键的丢失也会导致酶稳定性和酶活力的丢失。agaXa是GH118一个耐热新型琼胶酶。此外，通过本项目的资助，还研究了另一株高产琼胶酶菌株ZC1的几种新型琼胶酶：降解琼脂糖产物为中聚合度新琼寡糖的低温琼胶酶M672，以新琼二糖为唯一产物的外切琼胶酶575，以及新琼二糖水解酶852。