红球菌P14降解多环芳烃关键酶细胞色素P450单加氧酶CYP108J1的研究

At present, microbial degradation is usually considered as the main pathway of removing the polycyclicaromatic hydrocarbons (PAHs) in the environment, and the study on their pathway and molecular mechanism on high-molecular-weight (HMW) PAHs biodegradation is one of the hot scientific topics in the current world. In our previous study, one marine bacterial strain Rhodococcus sp. P14 was isolated with a strong ability of PAHs degradation. Via the analysis of its biodegradation pathway as well as the whole genome, we firstly demonstrated that strain P14 has a cytochrome P450 monooxygenase CYP108J1, which can catalyze the epoxidation process of four different PAHs, including benz[a]anthracene. In CYP108J1 gene cluster, there are two LuxR family regulatory proteins (NarL and MatL), which might regulate the expression of gene cyp108J1. Through the use of bioinformatics, biochemistry and molecular biology techniques, this proposal intends to investigate the substrate range of CYP108J1, the substrate binding site, the catalytic reaction mechanism as well as the enzyme structure-function relationship for further exploring the regulative mechanism of regulatory proteins (NarL and MatL) involved in gene expression of CYP108J1.The results will help to reveal the molecular mechanism of strain P14 on the degradation of PAHs compounds and also accelerate the application of utilizing P450 monooxygenase of PAHs pollution control.

微生物降解是目前公认的环境中多环芳烃清除的主要途径，对高分子量多环芳烃降解途径、降解机制的研究是国内外研究的热点。申请者前期分离到一株具强降解多环芳烃能力的海洋红球菌P14，通过对其降解途径及基因组信息的研究，首次发现一种来源于细菌的能催化四环以上的多环芳烃环氧化、且底物范围较广的细胞色素P450单加氧酶-CYP108J1，且该基因的表达可能受其上游存在的两个LuxR家族调控蛋白NarL和MatL的调控。本项目拟利用生物信息学、生化与分子生物学等技术，研究CYP108J1底物范围、底物结合位点、催化反应机制、酶结构与功能的关系，探索调控蛋白NarL、MatL等对CYP108J1基因表达的调控机制。本研究项目将为有助于揭示红球菌P14降解多环芳烃的分子机制，为P450单加氧酶应用于环境中芳香性污染物的降解中提供理论基础。

微生物降解是目前公认的环境中多环芳烃清除的主要途径，对高分子量多环芳烃降解途径降解机制的研究是国内外研究的热点。项目负责人前期发现海洋红球菌P14中具有一个能高效催化不同多环芳烃环氧化的细胞色素P450单加氧酶CYP108J1，本项目系统地研究了红球菌P14基因簇CYP108J1的结构、功能和调控机制。 .通过基因克隆、优化表达载体和宿主及表达条件，获得了能高效表达CYP108J1及其调控蛋白NarL、MalT的工程菌株；检测工程菌对多环芳烃的转化情况发现，CYP108J1可以高效转化菲、联苯、苯并蒽和蒽。基于同源建模和活性中心预测结果，对CYP108J1进行定点突变、构建了7个点突变体，最终验证并确定了多个影响CYP108J1功能的氨基酸活性中心位点L132F、S202Q、L278G。利用荧光标记和双向截短方式，对CYP108J1基因簇的一段潜在启动子区域进行系统地分析和定位，确定了其转录功能以及该启动子的-35区、-10区和转录起始位点区域，解析了CYP108J启动子区的结构组成。同时，借助原核细菌单杂交、EMSA、基因敲除等方法，证明了CYP108J1基因簇中的调控蛋白NarL通过直接结合在CYP108J1的启动子序列这一方式，从而阻遏抑制了功能基因cyp108j1的转录表达；当NarL被敲除后，CYP108J1的表达量也随之提高。最后，通过改变CYP108J1启动子P3序列上的一段特定回文序列，使得NarL与P3的体外结合能力丧失，进而确定了NarL与CYP108J1启动子序列的结合位点。.此外，对芘胁迫下红球菌P14转录组分析发现，在芘胁迫前期，大量的调控蛋白、膜蛋白和功能基因在金属离子的介导下共同作用于红球菌P14；金属离子介导的膜蛋白运输可能是芘进入红球菌P14的主要方式。对我国典型红树林区分离到的37株红球菌进行比较基因组学分析，发现与CYP108J1基因同源的CYP450基因广泛存在于其它一些具有多环芳烃降解能力的红球菌菌株中，这些基因所在的基因簇无论其结构组成和还是调控机制，都与红球菌P14中CYP108J1基因簇高度同源，具有高度的保守性。.项目成果不仅提升了CYP450单加氧酶在环境芳香性污染物降解中的应用价值，同时也为进一步阐明红球菌降解多环芳烃的机制、最终促进微生物的生态修复提供了重要的理论基础。