一种低温琼胶酶的作用机制研究

There are abundant microbial resources in the marine environment. And the discoveries of novel marine enzymes have become a hot field in the research of marine microbiology. Strain ZC1 is a novel marine isolate with a special degradation of agar. Agarase M672 from strain ZC1, which has the maximum amino acid sequence similarity of only 42% with those reported agarases, has distinct differences in the degradation of agar with those reported agarases. This project is aimed to obtain the recombinant expression of agarase M672 with high levels, then to characterize the enzyme properties of agarase M672 and to study its catalysis mechanism of agarose degradation and cold-adapted mechanism. The expected results of this project should benefit to knowledge of the catalytic mechanism of agarose degradation and cold-adaptation mechanism of agarases, and accelerate the research and application of agarase.

海洋环境中蕴藏着丰富的微生物资源，而海洋新型酶类资源的挖掘成为海洋微生物研究的新兴领域。菌株ZC1是本课题组前期研究分离到的一株拥有具独特琼胶降解性质的海洋新菌，从其基因组中克隆的琼胶酶基因M672，与目前已得到研究报道的琼胶酶最大只有42%的氨基酸序列相似性，并且其降解特性与目前报道的琼胶酶存在显著差异。本项目拟以结构、功能新颖的菌株ZC1琼胶酶基因M672为研究对象，在实现其高效表达的基础上，进一步研究其酶学性质及其作用机制和适冷机制。预期成果将初步阐述琼胶酶M672的作用机制和适冷机制，丰富琼胶酶作用机制研究，促进琼胶酶的开发和应用。

海洋环境中蕴藏着丰富的微生物资源，而海洋新型酶类资源的挖掘成为海洋微生物研究的新兴领域。菌株ZC1是本课题组前期研究分离到的一株拥有具独特琼胶降解性质的海洋新菌，从其基因组中克隆的琼胶酶基因M672，与目前已得到研究报道的琼胶酶最大只有42%的氨基酸序列相似性。本项目以新颖的糖苷水解酶GH16家族琼胶酶M672为研究对象，实现其高效重组表达，研究其酶学性质及作用机制。研究发现琼胶酶M672在pH 5.0-9.0的条件下具有较高的酶活力和稳定性；在20℃-40℃时活性较高，最适反应温度在25°C，属于低温琼胶酶。目前最适反应温度在室温的琼胶酶很鲜见，低温琼胶酶在室温下即可较有效的降解琼胶，不需加热设备，可达到降低生产成本的效果。琼胶酶M672的Vmax值为154.32U/mg，Km值为59.78 mg/ml。M672降解琼脂糖的产物是新琼四糖、六糖与八糖，不能降解八糖，而目前报道的很多GH16家族琼胶酶可以降解八糖。项目进行了琼胶酶M672的同源建模和酶催化活性部位研究，发现只含琼胶酶M672催化部位(位于N端)的重组蛋白具有琼胶酶活性，但活性比较低，说明M672的C端部分也对酶活性起着重要作用，这与同家族的一些琼胶酶存在差异。通过RT-PCR发现了琼胶酶M672只有在琼脂糖诱导下才出现基因转录，说明琼胶酶M672是个琼胶诱导酶。为了进一步了解琼胶酶M672的性质以及与M672进行比较，本项目还研究了菌株ZC1中另外一个同属于GH16家族的琼胶酶E075，以及菌株HZ105的GH16家族琼胶酶HZ4的性质。通过比较发现，M672与E075和HZ4存在较大的一些差异，从最适合反应温度、最适底物浓度上来看在室温的M672相比E075更适合在室温下降解琼胶。因此推测，在自然的海洋环境中，海洋细菌ZC1可能先通过产生琼胶酶M672去降解处于固态的琼胶碳源。本项目的研究丰富了琼胶酶和海洋新型酶类资源研究，有利于琼胶酶的开发和应用。