海洋红球菌P14降解雌二醇的机制研究

Microbial degradation is the main pathway to remove steroid in the environment. However, less studies are focus on the metabolism pathway and mechanism of steroid microbial degradation. The mechanism of organic pollutant （PAHs）degradation in marine strain Rhodococcus sp. P14 was studied depending on several funding from the NSFC. Recently, it has been confirmed that strain P14 could grow with estradiol as the sole carbon and energy source, Moreover, various important genes related to estradiol degradation are present in it’s genome. This project intends to reconstruct the metabolic network of estradiol degradation in strain P14 by studying on the intermediate products and functional genes related to the estradiol degradation using genome and transcriptome analysis. The gene differentials between P14 and closely related Rhodococcus strains are studied by using bioinformatics for construction of the network. Furthermore, the project intends to reveal the mechanism of steroid degradation in strain P14 by confirming the metabolic network of estradiol degradation using heterogenous expression and deletion of functional and regulation genes. This project will help to reveal the molecular mechanism of marine microbe on the degradation of steroid and also accelerate the application of utilizing microorganisms of steroid pollution control.

微生物降解是环境中类固醇激素清除的主要途径，然而国内外对微生物降解类固醇激素的代谢途径及机制的研究还很少。通过国家自然科学基金项目的持续资助，申请者前期较系统地研究了海洋红球菌P14（Rhodococcus sp. P14）对有机污染物（多环芳烃）的降解机制，近期又证实菌株P14能以雌二醇为唯一碳源和能源生长、并存在降解雌二醇的关键酶。本项目拟借助基因组学、转录组学、生物信息学等手段，深入分析菌株P14降解雌二醇过程中的中间产物、功能基因，比较菌株P14与具不同功能特性的近缘红球菌菌株之间的基因差异等，从而重构菌株P14降解雌二醇的代谢网络；进一步基于降解功能基因及调控蛋白相关基因的异源表达或敲除，验证和调整雌二醇的代谢网络，初步揭示红球菌P14降解雌二醇的机制。本项目的实施将有助于解析海洋微生物降解雌激素的机制，并为功能微生物应用于环境中类固醇激素的修复提供理论基础。

随着我国经济及工业的发展，环境雌激素污染日益加剧，对环境及人类健康造成严重危害。微生物降解在环境雌激素生物修复中具有重要作用，然而国内外对雌激素的微生物降解途径及机制的研究还很少。.本项目以具有高效雌激素降解能力的海洋红球菌P14为研究对象，首先利用成熟的化学分析手段，鉴定得到了红球菌P14降解雌二醇过程中的关键中间产物（雌酮和16-羟基雌酮等）；进一步通过转录组及基因功能分析，发现17β-HSD和17β-HSDx酶具有催化雌二醇转化为雌酮的功能，CYP123A9酶具有催化雌酮转化为16-羟基雌酮的功能。由此，构建了菌株P14降解雌二醇的代谢途径：雌二醇通过短链脱氢酶（17β-HSD）脱氢形成雌酮，通过细胞色素P450（CYP123A9）羟基化形成16-羟基雌酮；然后在D环位置裂解，经由邻苯二甲酸和原儿茶酸通过β-酮己二酸降解途径，之后进入脂肪酸代谢、蛋白质代谢、糖代谢等进行碳源利用，最终进入三羧酸循环彻底降解。.其次，利用基因过表达、启动子预测与活性验证等手段，发现在调控蛋白TetR存在时egfp和CYP123A9都表达上调，证明TetR具有转录激活因子活性、且解析了TetR与启动子的结合位点及结合方式。通过转录组学和比较基因组学，分析菌株P14和其它31株红球菌基因组的核心基因、元基因组以及独特基因，发现红球菌物种的特有基因簇：三个细胞色素P450、两个短链脱氢酶、两个TetR调控蛋白等均与雌激素降解相关；并以此重构了菌株P14的雌二醇代谢网络。通过降解功能基因及调控蛋白相关基因的异源表达，进一步验证了雌二醇的代谢网络，初步揭示了红球菌P14降解雌二醇的机制。.此外，以与红球菌P14同属的雌二醇降解菌BH2-1为对象，通过比较基因组学以及基因功能分析，发现该菌也具有将雌二醇转化为雌酮的脱氢酶以及催化雌酮转化为16-羟基雌酮的CYP450家族的同工酶，进一步验证了以红球菌P14为代表的典型雌二醇微生物降解代谢网络。.项目所获成果不仅初步解析了红球菌降解雌二醇的机制，也为功能微生物应用于环境雌激素的生物修复提供了理论基础，提升了海洋微生物在环境污染物生物修复中的应用价值。