类胰岛素肽7与其G-蛋白偶联受体RXFP3相互作用的分子机制

Insulin-like peptide 7 (INSL7), also known as relaxin-3, is a new member of the insulin superfamily identified as a neuropeptide in 2002. It is predominantly expressed in the brain and involved in the regulation of food intake, stress response, arousal and sensory by activating its cognate G-protein coupled receptor RXFP3, but their interaction details are largely remained unknown so far. Therefore, we proposed to study their interaction mechanism from the views of both the ligand and the receptor. For study of the receptor, we plan to first disclose the ligand-binding pocket of RXFP3 through photoaffinity labeling by using the easily prepared photoactivatable INSL7 B-chain analogues, and subsequently identify the key ligand-binding residues in the ligand-binding pocket of RXFP3 by alanine-scanning mutagenesis. For study of the ligand, we plan to solve the receptor-bound three-dimensional structure of INSL7 through NMR technology by using the stable isotope-labeled ligand and the recombinant receptor, thus revealing the receptor-binding residues and the receptor-binding induced conformational change of INSL7. Demonstrating the molecular mechanism of the ligand-receptor interaction will provide new valuable insights for designing novel RXFP3-specific agonistic or antagonistic INSL7 analogues as well as the interaction studies of other insulin-like peptides with their receptors.

类胰岛素肽7（INSL7，亦称为松弛素3）是2002年才发现的一个属于胰岛素超家族的神经肽。它主要在脑中表达，通过激活G-蛋白偶联受体RXFP3参与了食欲、压力、应激、感知等相关生理功能调控，但目前对两者相互作用的细节还知之甚少。鉴于此，我们拟从配基和受体两个互补的角度研究INSL7与RXFP3相互作用的分子机制。从受体角度，先利用易于制备的光活化INSL7 B-链类似物通过光照交联的方法定位RXFP3中配基结合口袋，再通过丙氨酸扫描确定配基结合口袋中参与INSL7结合的关键残基。从配基角度，利用稳定同位素标记的配基及重组表达的受体通过NMR方法解析RXFP3结合状态下INSL7的三维结构，确定参与受体结合的关键残基及受体结合诱导的构象变化。阐明两者相互作用的分子机制将为设计对RXFP3更专一的激动性或拮抗性INSL7类似物提供理论依据，对研究其它类胰岛素肽与受体的相互作用也有借鉴意义。

类胰岛素肽7（INSL7，又称松弛素3，即relaxin-3）是一个属于胰岛素/松弛素超家族的神经肽，成熟形式由A、B两条肽链构成，且含有3对二硫键。通过激活主要在脑中表达的G蛋白偶联受体RXFP3，INSL7在摄食、压力调节等方面发挥调控作用。因此INSL7/RXFP3配基-受体对是潜在的药物干预靶点，阐明其相互作用的分子机制具有重要意义。近4年来，我们围绕该项目开展了一系列相关研究，取得了重要阶段性进展，详述如下。（1）依据突变配基与突变受体间的活力变化情况，不但确定了RXFP3上结合INSL7的关键部位，而且确定了两者上一些关键残基的相互作用关系。我们的工作揭示了RXFP3第二个跨膜螺旋胞外端高度保守的WxxExxxD模体是结合INSL7的主要部位，该模体中埋藏最深的疏水Trp138残基与INSL7 B-链C-端高度保守的B27Trp形成疏水相互作用，而带负电荷的Glu141和Asp145则分别与INSL7上带正电荷的B26Arg和B12Arg/B16Arg形成静电相互作用。进一步研究表明类似的相互作用在同源的RXFP4和配基INSL7及INSL5间也存在。（2）通过甲醇酵母重组表达，建立了制备13C/15N稳定同位素标记杂交分子R3/I5（RXFP3的高效激动剂）的有效方法，为通过NMR方法解析RXFP3结合状态下R3/I5的结构提供了关键材料。（3）开发了基于NanoLuc荧光素酶的新型超灵敏生物发光示踪剂，用于定量测定各种配基与RXFP3的结合活力。我们还将其推广到其它蛋白质多肽激素，广泛验证了其有效性，并提供了切实可行的制备方法，极大便利了受体结合活力测定。（4）通过将NanoLuc报告基因与受体RXFP3融合，建立了一种在活细胞上实时定量测定RXFP3内吞的新方法，为研究RXFP3与配基相互作用提供了一种新的测定方法。（5）阐明了松弛素家族多肽区分同源受体RXFP3和RXFP4的分子机制，为设计对RXFP3更专一的激动剂或拮抗剂奠定了基础。近4年来，相关研究工作已经发表标注本项目资助的SCI论文16篇，累计影响因子约60，使本课题组成为国际上研究类胰岛素/松弛素家族多肽的一支重要力量。该项目已经培养毕业博士生3名、硕士生2名，形成了稳定的研究队伍，为后续研究打下了良好的基础。