用新型生物发光探针研究胆固醇调控松弛素家族多肽受体RXFP3结合配基的分子机制

The relaxin family peptide receptor RXFP3 is a G protein-coupled receptor with relaxin-3 (also known as INSL7) as its endogenous ligand. The relaxin-3/RXFP3 system plays important roles in the regulation of food intake, stress response, and arousal. In recent work, we found that cell membrane cholesterol differentially modulates binding of RXFP3 with the agonist R3/I5 and the antagonist R3(Bdelta23-27)R/I5 by using novel ultrasensitive bioluminescent probes. On this basis, we hope to study how cholesterol modulates the ligand-binding of RXFP3 from the views of membrane lipid, receptor, and ligand, using the novel ultrasensitive bioluminescent probes. First, we plan to determine the key moieties of cholesterol that modulate the ligand-binding of RXFP3 through measuring the ligand-binding of RXFP3 after incorporation of various cholesterol analogues into the cholesterol-free insect cells. Second, we plan to determine the key cholesterol-binding residues of RXFP3 through measuring the cholesterol sensitivity of mutant RXFP3s carrying mutations in the transmembrane region. Third, we plan to systematically study the influence of cholesterol on ligand-binding of RXFP3 through measuring the binding potencies of RXFP3 towards various natural or mutant ligands under the normal or cholesterol-depleted conditions. Our present project will disclose the molecular mechanism of cholesterol modulating ligand-binding of RXFP3, and might also identify novel RXFP3 modulators.

松弛素家族多肽受体RXFP3属于G蛋白偶联受体家族，内源配基为松弛素3（relaxin-3），该配基-受体系统在摄食、压力、应激等方面发挥重要调控功能。我们近期利用超灵敏新型生物发光探针发现RXFP3与激动剂和拮抗剂的结合受细胞膜中胆固醇的差异调控。在此基础上，我们希望利用新型生物发光探针从膜脂、受体、配基三个角度深入研究胆固醇如何调控RXFP3结合配基。首先，通过测定无胆固醇昆虫细胞膜中掺入各种胆固醇类似物对RXFP3结合配基的影响，确定胆固醇中调控RXFP3结合配基的关键基团。然后，通过测定跨膜区残基突变后RXFP3对胆固醇的敏感性变化，确定RXFP3中结合胆固醇的关键残基。最后，通过测定有无胆固醇两种条件下RXFP3对各种天然或突变配基的结合活力，全面认识胆固醇对RXFP3结合配基的影响。该申请将阐明胆固醇调控RXFP3结合配基的分子机制，并有望获得新型RXFP3功能调控分子。

松弛素家族多肽受体RXFP3属于A家族G蛋白偶联受体，是一个具有7次跨膜结构的整合型膜蛋白。RXFP3主要在脑中表达，其内源激动剂是神经肽relaxin-3，该系统参与摄食、压力、应激等重要生理功能调控，也是一些疾病潜在的药物干预靶点。本项目中，我们围绕“胆固醇调节RXFP3结合配基的分子机制”开展了一系列研究工作。1、利用基于NanoLuc荧光素酶的新型超灵敏生物发光探针，我们证明了细胞质膜中的胆固醇对RXFP3结合配基具有调节作用。去除质膜中的胆固醇可以显著增加RXFP3对强拮抗剂R3(∆B23-27)R/I5的结合活力，但对RXFP3结合激动剂R3/I5和弱拮抗剂INSL5却影响不大。2、通过残基互换，我们证明了R3(∆B23-27)R/I5中B5Tyr和B12Arg残基决定该拮抗剂能响应胆固醇对RXFP3结合配基的调节作用。3、利用NanoBRET和NanoBiT技术，我们为受体RXFP3开发了均相配基结合测定新方法，用于研究胆固醇的调节作用及RXFP3结合配基的分子机制。4、利用基于NanoBiT的均相配基结合测定新方法，我们确定了RXFP3与激动剂R3/I5和拮抗剂R3(∆B23-27)R/I5的静电相互作用和疏水相互作用，揭示了配基和受体中一些关键相互作用残基的对应关系。5、通过对激动剂R3/I5的突变分析，为受体RXFP3设计开发了选择性激动剂和拮抗剂，有助于RXFP3生理功能研究。6、对RXFP3跨膜区进行了大量定点突变，发现这些突变并未显著改变胆固醇对RXFP3结合配基的影响；同时胆固醇类似物对RXFP3结合配基的影响也与胆固醇的影响相似，具体机制还有待进一步探讨。本项目已发表标注本项目资助的SCI研究论文13篇，总影响因子近50，累计被引用近70次；该项目已培养博士毕业生2名、硕士毕业生1名，目前还有在读博士生、硕士生各3名，形成了一支稳定的研究队伍，为后续研究打下了良好的基础。