寻找类胰岛素肽6（INSL6）的受体

类胰岛素肽6（INSL6）是1999年才发现的一个与胰岛素同源的多肽，主要在睾丸中表达，推测其可能与雄性生殖相关，但它的受体至今未找到，成为其功能研究的瓶颈。本申请拟在重组表达INSL6的基础上，通过生物化学和生物信息学的方法确定INSL6的受体。（1）用放射性同位素标记的重组INSL6为探针，用动物组织器官的细胞膜提取物为受体来源，建立INSL6的受体结合测定体系，确定INSL6受体表达的组织器官特异性及其与INSL6结合的亲和力及特异性。（2）通过配基亲和层析等方法从高表达INSL6受体的动物组织器官中分离纯化该受体，通过化学测序及质谱测序等方法获得其部分氨基酸序列，然后通过序列同源比对从数据库中找出可能的INSL6受体。（3）获得候选INSL6受体的cDNA并在动物细胞中重组表达，再通过受体结合测定等方法确认INSL6受体。该项目可以为揭示INSL6在雄性生殖中的作用打下基础。

类胰岛素肽6（insulin-like peptide 6, 简称INSL6）是1999年克隆的一个胰岛素超家族成员，主要由睾丸精母细胞表达，在精子生成过程中发挥作用。然而INSL6的受体还未找到，阻碍了对其生理功能的深入研究，因此我们希望通过本课题的研究能够找到INSL6的受体。近3年来围绕该课题我们开展了一系列相关工作。（1）建立了INSL6的制备体系，通过在大肠杆菌中重组表达设计的单链INSL6前体结合体外再折叠与化学切割，获得了双链INSL6。（2）通过在INSL6的B-链N-端引入Avi-tag，利用生物素连接酶在Avi-tag上引物生物素，从而获得了定点单生物素（biotin）标记的INSL6。（3）通过sortase催化的转肽反应，获得了B-链N-端及A-链N-端铕标记的INSL6。（4）2009年底报道的INSL6基因敲除小鼠研究表明INSL6与精子成熟相关，我们通过测定生精障碍病人INSL6的基因序列，从249名病人中找到一个杂合型R171H错义突变，该突变可能影响INSL6前体的加工成熟，从而可能与人类生精障碍相关。（5）利用有标记INSL6，检测了多种小鼠组织及多种培养细胞的膜提取物，但未发现特异性INSL6结合活力，可能由于内源INSL6受体的丰度太低。（6）将逆转录病毒包装的小鼠睾丸cDNA文库高效导入NIH3T3细胞，利用生物素标记的INSL6通过磁珠分选结合INSL6的转染细胞，但也未能找到INSL6的受体。（7）鉴于INSL6与精子成熟相关，我们筛选了10多个在睾丸中特异性表达或高表达的孤儿G-蛋白偶联受体，但这些孤儿受体在细胞测试中都对INSL6无反应。（8）为了解INSL6受体可能的特性，我们也在已知4个类胰岛素肽受体与配基相互作用方法开展了一些工作。总之，虽然经过多种尝试，到目前我们还未找到INSL6的受体，国内外亦无相关报道，说明该工作的难度很大。最近我们发现微荧光素酶（nanoluciferase）标记的INSL7还具有高受体结合活力，该酶标配基的检测灵敏度比铕标记及碘-125标记配基高100倍，因此在后续工作中我们拟制备酶标INSL6并用于受体的筛选工作。