从孤儿G蛋白偶联受体中筛选蛋白质多肽激素的受体

Protein/peptide hormones are an important group of endogenous signal molecules that exert various biological functions by activating specific membrane receptors of the target cells. It is known that protein/peptide hormones can activate more than 100 G protein-coupled receptors (GPCRs), being an important group of the endogenous GPCR ligands. In recent years, some novel protein/peptide hormones have been discovered, thus identification of their receptors becomes an important task. So far, there are over 100 orphan human GPCRs, we deduced that a substantial portion of these orphan GPCRs are probably the receptors of protein/peptide hormones. In the present project, we plan to screen receptors of some protein/peptide hormones from 95 orphan human GPCRs recently generated in our laboratory. First, preparing over 40 human protein/peptide hormones with unknown receptors through recombinant expression in E. coli or chemical peptide synthesis and labeling them by fluorescent probe. Second, screening the orphan human GPCRs overexpressed in HEK293T cells one by one through visualization of the ligand-induced receptor internalization and reporter assay of the G protein signaling pathways, identifying the activated receptors and confirming the novel ligand-receptor pairs. The present screening approach would establish a tight connection between protein/peptide hormones and orphan GPCRs and hopefully identify 1-2 novel ligand-receptor pairs, thus paving the way for further functional studies and drug development.

蛋白质多肽激素是一类重要的内源信号分子，通过激活靶细胞膜上特定受体发挥功能，已知能激活100多个G蛋白偶联受体（GPCRs），是一类重要的GPCR内源配基。近年发现了一些新的蛋白质多肽激素，找到它们的受体成为一项重要任务。目前还有100多个孤儿GPCRs，我们推测其中相当一部分可能是蛋白质多肽激素的受体。在本项目中，我们拟从本实验室最近构建的95个人源孤儿GPCRs中筛选蛋白质多肽激素的受体。首先通过大肠杆菌重组表达及化学肽合成获得40种以上受体未知的人源蛋白质多肽激素并用荧光探针标记。随后通过配基诱导受体内吞可视化观察和G蛋白信号通路报告基因测活两种筛选方法，逐一测试过表达在HEK293T细胞中的孤儿GPCRs，找出可被激活的受体并进一步确认。该筛选策略有望在蛋白质多肽激素和孤儿GPCRs间架起一座有效沟通的桥梁，预期找到1-2个蛋白质多肽激素的受体，为深入功能研究及药物开发打下基础。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的一类细胞膜受体，也是最重要的一类药物靶点。蛋白质多肽激素是最大的一类信号分子，也是最大的一类GPCRs内源配基。目前，还有100多个GPCRs的内源配基未知，因此它们被称为孤儿受体；同时，也还有很多蛋白质多肽激素的受体未知，虽然对其生理功能已经有了一定的了解。因此，本项目中我们开展了以下工作，希望从克隆的孤儿GPCRs中筛选蛋白质多肽激素的受体。(1)通过在蛋白质多肽激素的合适位点偶联或融合NanoLuc荧光素酶，我们开发了新型超灵敏生物发光示踪剂，用于通过配基-受体结合的方法筛选孤儿GPCRs。(2)利用NanoBRET和NanoBiT技术，我们开发了新型均相配基-受体结合测定体系，用于研究GPCRs与蛋白质多肽激素的作用机制。(3)我们用40多种重组表达或化学合成的蛋白质多肽，通过结合、激活、内吞等多种方法对过表达在人胚肾(HEK)293T细胞上的100多个孤儿GPCRs进行了筛选，发现之前报导的一些配对关系并不能被验证。(4)通过结合及激活测定，我们证明了肝脏表达抗菌肽LEAP2其实是ghrelin受体GHSR1a的竞争性拮抗剂，而不是之前报导的非竞争性拮抗剂，而且发现LEAP2具有不易从受体解离的特性及加入方式依赖的罕见拮抗模式。(5)研究了本实验室长期关注的类胰岛素/松弛素家族多肽与其G蛋白偶联受体RXFP3和RXFP4相互作用的分子机制，并设计开发了新型激动剂和拮抗剂。本项目相关研究工作目前已发表标注本项目资助的SCI论文19篇，总影响因子约70，累计被引用近百次，该项目已培养毕业博士生、硕士生各4名，形成了一支稳定的研究队伍，本课题组成为国内外蛋白质多肽激素研究的一支重要力量。