先天性心脏圆锥动脉干畸形遗传易感基因的识别与鉴定

心脏圆锥动脉干畸形（CTA）是严重先心病的代表性类型，是造成婴儿和新生儿死亡最主要的原因之一。国内外和我们的既往研究发现TGFβ2、Vangl2、Cx43、HIRA、RXRα、Pax3等6个基因可能是CTA的遗传易感基因，但需要进一步证实。我们拟针对这6个基因展开以下研究：① 在大样本CTA患儿中检测基因的序列和启动子甲基化状态；②神经嵴细胞是形成心脏流出道单独关键细胞，应用shRNA下调单个或组合基因，观察下游基因或信号通路的变化对神经嵴细胞发育的影响；③应用吗啡啉修饰的反义核酸下调斑马鱼受精卵中基因的表达，观察斑马鱼心脏发育状况；④应用精原细胞注射shRNA方法下调单个或组合基因，观察小鼠心脏流出道发育情况。通过以上研究，确定此6种基因是否是CTA的主要致病基因，明确它们的调控机制。本研究不仅可为阐明CTA的发生机制和遗传学干预提供理论依据,而且可为研究其它先心病的发病机制提供参考。

先天性心脏圆锥动脉干畸形(CTA) 是一类最常见的重症先心病，多个基因参与其发病机制。本课题主要针对 TGFβ2、Vangl2、Cx43、HIRA、RXRα、Pax3 等基因，从人群样本研究着手，分析基因序列、DNA修饰状态和表达，确定基因启动子和编码区的突变位点、SNP 和DNA修饰位点及其对组织表达的影响。课题按计划完成了6个基因的序列分析、表达水平检测和UTR区甲基化状态分析。上述基因序列罕见编码区的突变，但启动子区发现多个SNP位点，考虑可能与CTA遗传易感性有关。发现法洛四联症（TOF）患儿右室流出道心肌组织Cx43基因mRNA和蛋白表达明显增高（p = 0.0006），HIRA、RXRA和VANGL2的mRNA和蛋白水平均明显下降（p <0.01），而TGFβ2和Pax3无明显变化。由于Cx43基因的上调、下调均参与CTA的发生，我们分析了Cx43基因敲除胎鼠心肌化过程中流出道隔的表达谱变化，发现Galpha13信号通路和TGFβ/BMP信号通路的异常可能与其流出道梗阻性病变相关，Bmp2/Bmpr2的异常表达可能与心脏流出道隔心肌化延迟后不成熟心肌的异常增生有关。通过对Cx43启动子区序列分析，发现Cx43 第一外显子上游425bp附近存在视黄酸作用元件的DNA序列，并证实RXRα可调控Cx43的表达。考虑到在上述6个基因编码区未发现热点突变，我们通过外显子组测序，在CTA病例中寻找新的候选基因，新发现WDR62基因编码区存在多个突变。我们采用吗啡啉和TALENT技术观察了wdr62在斑马鱼心脏发育中的作用,结合心肌原代细胞培养，研究WDR62突变体对心肌细胞分化的影响。鉴于环境因素和遗传因素均可能参与先心病的发生，我们进行了表观遗传学研究，包括DNA甲基化、microRNA和组蛋白修饰等分析。发现TOF心肌组织中一些特异性的甲基化调控和组蛋白修饰变化；一些心脏特异性miRNA的表达也发生了变化。这些结果提示表观遗传学机制可能在CTA发病过程中扮演重要角色。本研究结果为深入开展先心病的发病机制和临床干预研究提供了有价值的参考依据。多篇研究论文已经发表在国内外重要学术期刊。