SMYD4：一个新的先天性心脏病候选基因的识别与验证

Congenital heart disease (CHD), one of the most common birth defect, affects the life quality of the patients and is also the leading cause of death in infants. So,it’s important to study the pathogenesis of CHD. Our previous whole exome sequencing (WES) results have suggested that the gene SMDY4 may be a new candidate gene of CHD. But this phenomenon and its mechanism should be further confirmed. We plan to launch the following research, including ① Detecting the DNA sequence, the expression and its regulation of the gene SMYD4, to reveal whether there’re the SMYD4 gene defects in patients with CHD. ② To create the model organism SMDY4 gene knockout zebrafish by using the technique of CRISPR/Cas9, then elucidate the cardiac phenotype of the zebrafish with SMYD4 gene defect. ③ To make clear the effect of SMYD4 gene on the function of myocardial cell, analyze the proteins interacting with SMYD4, and explicate the signal pathway or regulation network in which the gene SMYD4 participating at the cellular level, and the molecular mechanism of SMYD4 in the occurrence of CHD. Based on the above serial study, on the level of patients with CHD, model organism zebrafish and model cell, from phenotype to genotype, then from genotype to phenotype, combined with the mechanistic investigation, we expect to elucidate the role of gene SMYD4 in the pathogenesis of CHD and its mechanism. In addition, the research thinking and method will provide references for other birth defects.

先天性心脏病（简称先心病）是严重影响患者生命和生活质量的出生缺陷，研究其发病机制有重要意义。我们前期的全外显子组测序结果提示，SMYD4可能是新的先心病候选基因，但需进一步证实。拟开展以下研究：①检测SMYD4基因表达、DNA序列及其表达调控，揭示先心病患者中是否存在SMYD4基因缺陷；②采用CRISPR/Cas9技术敲除模式生物斑马鱼smyd4基因，明确smyd4基因缺陷对斑马鱼心脏表型的影响；③在细胞水平研究SMYD4基因对心肌细胞功能的影响，分析SMYD4基因相互作用蛋白，明确SMYD4在心脏发育过程中所参与的信号通路/调节网络以及SMYD4参与先心病发生的机制。通过上述系列研究，在先心病人群、模式生物斑马鱼和模式细胞等多种水平，从表型到基因型、再从基因型到表型，并进行机制研究，逐层深入地阐明SMYD4基因在先心病发生中的作用及其机制。该研究思路可为其他出生缺陷的病因学研究提供参考。

SMYD家族是一类组蛋白甲基转移酶，SMYD1、SMYD2和SMYD3在骨骼肌发育和心肌发育过程中都发挥重要的作用，然而SMYD4在脊椎动物发育过程中的功能还所知甚少。我们通过二代测序发现部分先心病患者存在SMYD4基因变异，拟进一步通过模式生物整体观察，结合心肌细胞分子相互作用，部分阐明SMYD4及其突变对心脏发育的影响及其分子机制。在208例先心病患者中鉴定到了3个稀有变异，分别为（c.C837T，p. H279H, c. 1034G>A，p. G345D 和c. 1736G>A， p.R579Q)，其中，G345D预测致病性突变，该突变导致了蛋白结构的显著变化。原位杂交显示smyd4在斑马鱼心血管系统中能够特异性显著表达，提示smyd4在斑马鱼心脏发育过程中发挥重要作用。CRISPR/Cas9的方法构建了smyd4L544Efs*1突变体斑马鱼，纯合突变体斑马鱼胚胎出现早期胚胎致死、发育迟滞以及严重的心脏畸形，提示smyd4对斑马鱼的胚胎发育和心脏发育至关重要。通过体外细胞学研究，发现SMYD4能够和一系列表观调控因子结合，如HDAC1、LSD1和TCF25等，提示SMYD4在表观调控和基因转录调控等方面发挥重要的作用。细胞免疫共沉淀证实G345D的变异破坏了SMYD4与HDAC1以及LSD1之间的结合；斑马鱼回补实验结果显示G345D变异会导致斑马鱼心脏发育异常。斑马鱼心脏组织和心肌细胞HL-1的RNA-sequencing数据显示SMYD4功能缺失后，组织和细胞内基因表达谱发生显著的改变，提示SMYD4的功能与表观调控相关。在组织和细胞转录组的改变中，代谢通路以及Wnt信号等与心脏发育密切相关的信号通路发生了显著变化。在细胞层面上，通过ChIP-sequencing的方法我们鉴定到了SMYD4结合的靶基因。通过结合RNA-sequencing和ChIP-sequencing数据分析发现，在心脏发育中，Wnt信号通路可能是SMYD4一个重要的调控环节。本项目研究结果首次揭示了SMYD4在斑马鱼的胚胎发育以及心脏形成过程中至关重要，一方面SMYD4自身具有调控组蛋白修饰的功能，另一方面能够影响HDAC1、LSD1和TCF25等转录调控密切相关蛋白的功能，从而影响心脏发育。遗传学证据和功能学证据有力的证实了SMYD4的致病性变异是先心病的高危因素。