GIT2负调控NF-κB通路及其分子机制

NEMO是NF-κB通路中的关键调控分子，通过 K63泛素化修饰在NF-κB的负反馈调节中发挥重要作用；GIT2是一种支架蛋白，本身虽不具有激酶与泛素相关酶活性，但其具有作为平台分子募集不同分子调控信号通路的功能；GIT2敲除的小鼠表型反应了其在机体免疫调节与炎症反应中的重要作用。结合文献背景及我们的前期研究基础，我们提出GIT2可能通过募集A20对NEMO去泛素化进行调控，进而负调控NF-κB通路，从而在多种生理病理过程中发挥作用。本项目拟开展系列研究证明上述假设，并初步阐明其生理病理学意义。重点研究：GIT2 与NEMO、A20的作用位点及特征；GIT2影响NEMO泛素化的分子机制；GIT2负调控NF-κB的生理病理学意义。这对我们深入理解NF-κB信号途径调节机制、揭示GIT2在肿瘤发生发展转移过程中的作用；寻找肿瘤治疗的新靶点具有重要的科学意义。

NF-κB(NF-κB)在炎症、免疫、细胞应激和凋亡中扮演重要的角色。NF-κB经典途径的激活依靠其抑制亚基IκBα的磷酸化,而IκBα是由一个大分子量的多聚复合物调节的，即IκB激酶复合体。IKK激酶复合体是由两个催化亚基IKKα和IKKβ和一个调节亚基NEMO/IKKг(NF-κB essential modulator)组成。NEMO是IKKs和NF-κB激活所必须的分子，但是它的活性机制还没有完全阐明。GITs蛋白是近年来发现的具有脚手架功能的一类蛋白质，并且可作为多种信号传导通路的接头分子,前期实验表明，GIT2与NF-κB信号通路中许多关键的蛋白分子具有相互作用，我们推测GIT2有可能参与NF-κB信号通路，因此，我们以GIT2基因为主要研究对象，发现与之相互作用的蛋白，探讨其影响NF-κB的分子机制。.我们通过一系列体内体外实验证明GIT2与NEMO存在蛋白质相互作用，且GIT2与NEMO相互作用的位点可能是GIT2的ARFGAP、PBS结构域和NEMO的CC结构域，确定了GIT2(1-347 aa)与TRAF1存在相互作用。我们通过转录活性实验发现，GIT2、A20、TRAF1和NEMO均可以抑制NF-κB的转录活性，并且A20、TRAF1均可以和GIT2协同抑制NF-κB的转录活性。GIT2可以抑制TRAF2介导的NF-κB的转录活性，但不可以抑制IKKβ诱导的NF-κB的转录活性。通过复合体实验表明，GIT2可以促进A20与NEMO的结合并促进A20对NEMO的去泛素化，进而调控NF-κB的下游靶基因的转录。本研究为NF-κB的调控机制提供了新的线索。