TRIM67负调控NF-κB信号通路的分子机制研究

Tripartite motif proteins (TRIM) play an important role in host immunity against invading pathogens by directly or indirectly regulating innate immunity via pattern recognition receptors (PRRs), the IFN signaling pathway as well as NF-κB signaling pathway. In our previous study, we have found that host protein beta transduction repeat-containing protein (β-TrCP) can interact with TRIM67 by tandem affinity purification technology (TAP) and mass-spectrometric technique, and confirmed that TRIM67 can negatively regulate the activation of the transcription factor NF-κB upon TNF-α stimulation. Base on the interaction between TRIM67 and β-TrCP, we will focus on the following research in cell lines and TRIM67-/- C57 mice by molecular biology, protein interaction and immunity technology in this project. (1) The effect of TRIM67 on the regulation of NF-κB signaling pathway; (2) The molecular details such as critical domains or amino acid sites of the interaction between TRIM67 and β-TrCP; (3) The function of TRIM67 in the regulation of NF-κB signaling pathway by β-TrCP; (4) The roles of TRIM67 in inducing inflammation of brain tissue in TRIM67-/- C57 mice. This study will be helpful to clarity the molecular mechanism of the negative regulation of NF-κB signaling pathway and the inflammatory response of brain tissue by TRIM67 protein.

TRIM 家族蛋白通过直接或间接调控宿主模式识别受体(PRRs)、干扰素(IFN)以及NF-κB等信号通路，在抗病毒天然免疫中扮演着重要作用。我们通过串联亲和纯化及蛋白质谱技术发现TRIM67互作的宿主蛋白β-转导重复相容蛋白(β-TrCP)，并证实TRIM67负调控TNF-α诱导的NF-κB活性。在此基础上，本研究拟以TRIM67与β-TrCP相互作用为切入点，利用分子生物学、蛋白质互作和免疫学等技术，在细胞和TRIM67敲除小鼠上研究： (1) TRIM67调控NF-κB信号通路的关键途径；(2) TRIM67与β-TrCP相互作用关键结构域等分子细节的确定；(3) TRIM67在β-TrCP调控NF-κB信号通路中的功能; (4) TRIM67在诱导机体脑组织炎症中的作用。该研究为进一步揭示TRIM67负调控NF-κB信号通路及脑组织炎症反应的分子机制奠定了基础，具有重要的科学意义。

TRIM 家族蛋白通过直接或间接调控宿主模式识别受体(PRRs)、干扰素(IFN)以及NF-κB等信号通路，在抗病毒天然免疫中扮演着重要作用。本项目中，利用荧光显微镜观察和Western blot检测胞质核中p65的蛋白量发现TRIM67能显著抑制TNFα诱导的p65入核；TRIM67也能抑制TNFα诱导的TNFα和IL-6的mRNA表达，表明TRIM67可以抑制TNFα对NF-κB的激活作用。RING-B-box结构域对TRIM67发挥抑制作用其关键作用，而RING和C端PRY/SPRY的缺失及潜在磷酸化位点（S110h和S114）的突变都不影响TRIM67对TNFα诱导的NF-κB激活的抑制作用；进一步研究表明TRIM67在IkBα水平或其下游发挥对TNFα诱导的NF-κB激活的抑制作用。免疫沉淀实验，蛋白质谱鉴定分析和免疫共沉淀实验显示内源βTrCP与TRIM67存在相互作用，βTrCP的C端结构域和TRIM67的RING-B-box结构域介导了βTrCP与TRIM67之间的相互作用。此外，TRIM67 N端丝氨酸磷酸化位点对TRIM67与β-TrCP的互作至关重要，是其影响IkBα降解的重要位点，并影响下游促炎因子TNFα和IL-6的表达。另外，成功获得纯合子TRIM67敲除小鼠（TRIM67-/-），其原代成纤维细胞（MEFs）显示TRIM67的缺失可致炎症因子的产生明显上调。进而在RIM67-/-小鼠上评价了TRIM67对JEV诱导的脑组织炎症的影响，结果显示TRIM67同样通过影响IκBα的降解发挥负调控作用，但是这种负调控作用并不足以完全抵抗JEV引起的脑部炎症风暴。本研究揭示了TRIM67通过与βTrCP的相互作用负调控TNFα对NF-κB激活的分子机制，丰富了TRIM67在脑组织炎性因子产生调控中的作用，有利于未来对脑炎进行干预治疗，具有重要的理论和实践意义。圆满完成了计划任务书要求的任务，目前论文TRIM67 Suppresses TNFalpha-triggered NF-kB Activation by Competitively Binding beta-TrCP to IkBa已投稿Front. Immunol (Manuscript ID: 793147)，修回并修改完善中。已培养研究生3名，其中硕士研究生2名，博士研究生1名。