单核细胞白血病浸润转移的行为及机制研究（活体）

癌症转移是肿瘤学研究的重要前沿。本项目以单核白血病细胞的浸润转移为关键科学问题，利用斑马鱼发育与疾病模式生物体的独特优势，在前期单核巨噬细胞迁移研究工作的基础上，通过条件性的Cre/loxP过表达技术在斑马鱼造血系统进行白血病融合基因的转基因，力图建立"绿色"可示踪的单核白血病转基因斑马鱼模型。在此基础上，结合激光共聚焦显微镜成像技术，在活体内实时动态观察单核白血病细胞转移的"四维"生物学行为。进一步可阐明单核白血病细胞浸润转移的内在精确机制，并对相关机制进行临床血液学病例的检测，从而进行单核细胞白血病浸润转移的转化型医学研究, 具有开创性意义。

我们成功构建PSGH2 (AML1-EVI1:HSE:EGFP)和PSGH2 (MYCN:HSE:EGFP)重组质粒，和I-SceI大范围核酸转移酶一起共显微注射到野生型AB品系斑马鱼单细胞胚胎中，成功建立基于热休克的条件性转基因技术过表达人源AML1-EVI1基因、鼠源MYCN基因的“绿色”可示踪的转基因斑马鱼模型2个。经过验证、稳定传代后，我们对两个模型进行了包括外周血细胞涂片、qRT-PCR、流式细胞仪、全胚胎原位杂交、免疫组化、基因芯片等技术进行血细胞分型、造血转录因子表达、造血细胞周期分布、造血细胞种群改变和各相关信号通路的检测，初步阐明其过表达在造血发育形成和发展中的作用，并进行相关通路的初步探讨。.我们发现稳定转染后的TG（AML1-EVI1:HSE:EGFP）斑马鱼与野生型成鱼相比，F2代红系造血受抑，粒系的调控因子mpo表达量明显升高，表明红系分布向粒系造血转化，结合外周血出现大量类似原始的单个核细胞的堆积，这些细胞核染色质疏松，有些具有核仁，红细胞显著减少，与人类白血病患者外周血表型类似。提示AML1-EVI1融合基因在血液系统，具有抑制细胞分化、细胞增殖和自我更新能力的多功能蛋白，它既抑制AML1功能又具有EVI1致癌潜能。本课题中MYCN基因过表达，促进斑马鱼的早期造血和HSC的存活、增殖，导致大量早期细胞的堆积。随后的成长阶段，MYCN没有相应降解，从而使NDRG1不能正常表达，血细胞在肾髓和外周脏器堆积，却无法分化成熟，不具备正常的生理功能，最终导致病理性的造血，出现白血病样表型。由此可见，NRDG-1具有促进细胞分化、其负性表达与肿瘤的发生、发展、转移密切相关，并受MYCN的调控等功能特点；在肿瘤中的表达有助于区别癌细胞与正常细胞，使其可能成为癌的特异性标记物，或可作为早期转移的遗传标记物，使我们增强比组织形态学更加高级的分辨能力，有助于癌的早期诊断和治疗。实践证实，斑马鱼是血液病新兴的优势模型，有利于我们单基因调控后，进行可视性直观检测。