莪术醇相互作用蛋白及其抗肿瘤机制研究

Curcumol has been reported to be an anti-tumor natural compound, while the underlying mechanism is still unknown. It is of importance to identify direct curcumol-interaction proteins for uncovering its anti-tumor mechanisms and probing the new cancer therapy targets. Our laboratory has successfully developed a method of drug affinity chromatograph by conjugating curcumol to agarose beads via chemical modification of curcumol without interference of its antitumor function. In this project, drug affinity chromatograph and mass spectrometry methods are employed to identify potential curcumol-interaction proteins from subcellular protein extraction of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. The candidate target proteins will be validated by the methods of half-high throughput screening, drug pull-down，drug western dot blot and drug affinity responsive target protein stability. Furthermore, the protein level, protein post translational modification level, cellular localization, enzyme activity and downstream functions of the target protein will be detected to determine whether curcumol could regulate its target function by some of these pathways. We also propose to construct cell models, gain or loss of curcumol target protein functions, using lentivirus expression systems. These cell models are used to determine whether antagonist or agonist function is exerted by curcumol to its target protein, and to explore the downstream anti-tumor mechanisms mediated by curcumol-interacting protein.

莪术醇是一种抗肿瘤效果明确的天然化合物，鉴定莪术醇在肿瘤细胞中的相互作用靶点蛋白对阐明其抗肿瘤作用机制以及探索新的肿瘤治疗靶点具有重要意义。我们已建立了莪术醇配基亲和层析方法，并且利用此方法从293T细胞中鉴定出了潜在的药物相互作用蛋白。此项目拟利用莪术醇配基亲和层析方法结合质谱技术从鼻咽癌细胞亚细胞组分提取物中鉴定莪术醇潜在相互作用蛋白；然后利用半高通量筛查方法、药物Pull down、药物Western dot blot及药物诱导靶标蛋白稳定性检测等方法确定莪术醇相互作用蛋白。在此基础上，检测莪术醇对其靶标蛋白的调控作用，包括莪术醇靶标蛋白表达水平、翻译后修饰水平、细胞内定位、酶活力、及其与染色体或下游蛋白分子的结合能力等指标；并利用慢病毒系统构建靶标蛋白获得功能与缺失功能的细胞模型，利用此模型研究莪术醇通过其相互作用蛋白发挥抗肿瘤功能及其机制。

许多研究发现，莪术醇可以抑制鼻咽癌（NPC）增殖并诱导细胞凋亡，但其机制尚未完全阐明，其蛋白靶标在鼻咽癌细胞中仍不清楚。 在这项研究中，我们采用了基于质谱的化学蛋白质组学方法，发现了NPC细胞中莪术醇的可能蛋白质靶标并进行了验证，利用RNAi干扰及慢病毒表达系统分析莪术醇靶蛋白沉默后生物学功能的改变及莪术醇的抗癌作用是否发生影响，利用靶标蛋白、靶标蛋白＋莪术醇分别从细胞总蛋白提取物中 Pull down 靶点蛋白，研究莪术醇通过影响其相靶标蛋白与其它蛋白的结合来发挥功能。其主要结果如下：.1.将莪术醇修饰成莪术醇单酯，其生物活性未发生明显改变，进而用化学蛋白质组学捕获发现核仁素（NCL）是人类鼻咽癌细胞中莪术醇的蛋白靶标。.2.通过细胞热变换分析（CETSA）证实了莪术醇与靶蛋白的结合，二者之间发生了相互作用。.3.分子对接用于分析莪术醇与其靶蛋白之间发生相互作用结合构象及结合能，结果显示莪术醇与NCL结合的氨基酸位点，具有-7.8 kcal/mol的结合自由能。.4.我们在CNE-2细胞中进行了细胞功能分析，以确认靶蛋白在莪术醇中的作用抑制了NPC细胞的生长。细胞功能分析发现，莪术醇处理导致CNE-2和5-8f细胞中NCL降解，对NCL低表达细胞有轻微影响。RNAi干扰实验发现NCL沉默后，鼻咽癌细胞的增殖能力减弱，莪术醇对低表达NCL的鼻咽癌细胞增殖抑制作用也减弱，同时我们发现莪术醇对NCL低表达的鼻咽部正常细胞NP69的有轻微的增殖抑制作用。针对高NCL表达的癌细胞，莪术醇对正常细胞显示出很小的细胞毒性。 这可能是莪术醇对正常细胞几乎没有副作用的原因之一。.5.免疫荧光和亚细胞组分分级抽提实验结果显示定位在细胞膜上的NCL与鼻咽癌细胞的恶性生物学行为有关。莪术醇干预后能够减少鼻咽癌细胞膜上NCL的表达。利用慢病毒系统构建 NCL沉默的稳定细胞系，发现抑制NCL的表达可以抑制鼻咽癌细胞的增殖，侵袭及迁移。细胞增殖及划痕实验显示，莪术醇对NCL沉默的细胞作用较小。.6.利用NCL、NCL＋莪术醇分别从细胞总蛋白提取物中 Pull down 靶点蛋白，MALDI-TOF-TOF鉴定莪术醇干预后，可能影响了NCL与ANXA6,CUX1,MFA3L等蛋白的结合来发挥功能，还需要要进一步用WB进行验证。