绿原酸上调neuronatin抑制骨质疏松及其机制研究

The increasing of the apoptosis in bone marrow of mesenchymal stem cells (BMSCs) cause the decreasing of osteogenic precursors and bone formation, which is one of the main reasons for pathogenesis of osteoporosis (OP). Our primary study showed that chlorogenic acid from Eucommia ulmoides Leaves played important roles of anti-osteoporosis effect. According to the sequencing of the whole gene expression spectrum of BMSC from rats with OP, it detected that the Nnat (neuronatin) may be obviously increased by chlorogenic acid and the bone marrow of mesenchymal stem cells (BMSCs) from adult mice with OP decreased, suggesting that Nnat may be a new metabolic regulator of bone metabolism. Chlorogenic acid may increase the BMSC anti-apoptotic ability by up-regulating Nnat, thereby inhibiting OP. In this study, we intend to use the OP rat model, BMSCs cultured in vitro, and osteoblasts, through the method of qPCR and lentivirus-mediated RNA interference, to make sure the survival rate of Nnat in BMSCs , osteoblasts and its function in OP, then to investigate whether chlorogenic acid up-regulations in Nnat and inhibition in NF-κB signaling are the approaches for suppressing BMSC apoptosis and osteoporosis, and then to clarify its molecular mechanism in order to provide a new basis for the prevention and treatment of OP.

骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡增加，引起成骨前体细胞与骨形成减少是骨质疏松(OP)病理发生的重要因素。课题组前期研究发现，绿原酸是杜仲叶抗骨质疏松作用的主要成份，对绿原酸处理的OP大鼠BMSC进行全基因表达谱测序，筛选到Nnat (neuronatin)(一种可调节NF-κB信号的神经发育相关蛋白)可被绿原酸显著上调，且OP大鼠BMSC中Nnat下调，提示Nnat可能是新的骨代谢调节分子，绿原酸可能通过上调Nnat，增加BMSC抗凋亡能力，从而抑制OP。本课题拟利用OP大鼠模型与体外培养的BMSC与成骨细胞，采用qPCR、慢病毒介导RNA干扰等手段，从分子、细胞与整体水平确定Nnat在BMSC与成骨细胞存活，以及OP发生中的作用，探讨绿原酸是否通过上调Nnat与抑制NF-κB信号，从而抑制BMSC凋亡与骨质疏松，并初步阐明其分子机制，为骨代谢调节机制增加新观点，为防治OP提供新的依据。

骨质疏松症是以骨量降低和骨组织结构破坏，骨吸收大于骨形成为特征，最终造成骨脆度增加和易骨折的代谢性疾病。骨质疏松症多发于中老年，儿童骨质疏松相对于其少见，但其发生率处于上升的趋势。儿童时期的腹泻对儿童及成年期骨质疏松均具有重要影响，慢性腹泻会导致机体肠道吸收功能减弱，对胶原蛋白及钙吸收利用率降低，骨的强度、密度与钙具有较大的关联，机体肌肉、神经、肾、心、肝等组织器官发挥正常功能均依赖钙离子辅助，长期腹泻的患者，机体肠道功能长期处于亏损状况，经小肠吸收利用率降低，无法确保钙营养素正常输注到血液中。肠易激综合征是一种主要以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变为主要特征的功能性肠病。近年来研究发现既往曾有过急性胃肠道感染，在肠道感染病原体被清除后，有1/3的患者可存在持续的IBS症状，这一类有明确起病史的IBS亚型，称为感染后肠易激综合征。慢性腹泻患者肠道微生态环境失衡，肠道菌群是维持机体肠道微生物均衡的主要因素。多项研究发现绿原酸可通过调节肠道菌群有效改善以腹泻为主要症状的结肠炎小鼠的炎症反应。PI-IBS患者存在肠道菌群失调，并伴随肠道低炎症反应，内脏高敏感性，而表现出腹泻症状。因而课题组就PI-IBS疾病特点，展开绿原酸对PI-IBS的治疗效果及机制研究。一、构建PI-IBS大鼠模型，大鼠体重明显降低、结肠敏感性增高，结肠HE染色发现炎症细胞浸润、五羟色胺表达量增高；WB检测发现MLCK/p-MLC信号通路激活，肠上皮间紧密连接蛋白表达降低，骨钙降低。二、高通量测序检测PI-IBS大鼠肠道菌群，发现感染后肠易激综合征大鼠肠道菌群与对照组差异明显。三、绿原酸的补充显著恢复了造模后大鼠体重的降低和肠道屏障的完整性，降低了五羟色胺的表达，肠上皮间紧密连接蛋白表达恢复，抑制了MLCK/p-MLC信号通路的激活。四、绿原酸的补充恢复了肠道菌群的多样性，GC-MS检测表明显著改变了肠腔内的代谢物水平，恢复了骨质。该研究的开展对中药分子治疗PI-IBS提供了新的见解，为临床用药起到指导作用，奠定基础研究的基石。