奶山羊MAT基因调控羊奶短、中链脂肪酸合成机理的研究

在克隆乙酰/丙二酰单酰基转移酶(MAT)基因等前期工作基础上，以西农萨能奶山羊为实验材料，利用腺病毒介导的RNA干扰及基因超表达技术，分别干扰及超表达山羊乳腺上皮细胞MAT基因，通过Western 杂交分析蛋白表达，放射性标记法分析MAT酶活性，气相色谱-质谱联用法分析乳腺上皮细胞中脂肪酸组成及含量变化，实时定量PCR法测定MAT基因和其他脂肪酸代谢相关基因的表达水平，揭示MAT基因表达变化与乳腺上皮细胞和羊奶短、中链脂肪酸组成和含量变化的关系，提出奶山羊MAT基因调控乳腺上皮细胞分泌短、中链脂肪酸的信号通路假设，初步阐明山羊奶短、中链脂肪酸含量高的理论基础，为调控羊奶脂肪酸含量、探讨羊奶风味形成 机理及改善羊奶品质等提供理论和实验依据。

山羊乳腺脂肪酸合酶(FASN)的乙酰/丙二酸单酰基转移酶（MAT）功能域具有终止短、中链脂肪酸延长的活性，推测其对羊乳中短、中链脂肪酸的形成具有重要的调控作用。本研究通过分析MAT表达丰度与羊奶短、中链脂肪酸成分的相互关系，并利用MAT过表达和干扰技术研究MAT表达量对细胞脂肪酸代谢和脂肪酸成分的影响，探讨MAT对短、中链脂肪酸形成的调控作用，为揭示MAT调控羊乳中短、中链脂肪酸的形成机理提供依据，同时也为奶山羊的分子育种和转基因山羊的制备提供基因材料。主要研究结果如下：.（1）羊乳中C18:1和C16:0的含量最高，不同的脂肪酸成分之间呈现出显著相关性，并呈现簇状分布， MAT的表达量与C4:0和C20:1具有显著相关性，但与中链脂肪酸之间并没有显著的相关性。泌乳期MAT的表达量显著高于干奶期。山羊组织表达谱分析表明，MAT在脂肪、小肠和乳腺组织中表达量最高。.（2）克隆得到山羊MAT区域的序列，并构建腺病毒过表达载体。结果表明MAT过表达能够显著提高LPIN1、ADRP、ACSL1、FADS2、GPAM、SCD和ELOVL6等基因的表达，显著降低FABP3、TIP47、XOR、ACCα和THRSP的表达。MA T过表达对细胞脂肪酸的成分没有显著的影响。.（3）构建得到有效干扰MAT的shRNA腺病毒载体。在乳腺上皮细胞中干扰MAT能够显著降低ADRP、AGPAT6、ATGL、DGAT2、GPAT、TIP47、CD36、BTN1A1和SREBP的表达，提高HSL的表达。MAT干扰之后显著抑制细胞中C10:0、C12:0的含量，提高C14:0含量。.（4）通过体外纯化得到具有活性的MAT重组蛋白。真核表达MAT蛋白具有较强的酶活性。制作得到山羊MAT多克隆抗体。.（5）对MAT启动子的研究发现，SREBP1是MAT上游的主要调控因子，对调控MAT的表达具有重要的调控作用。. 综上所述，通过本项目的实施，发现体外表达纯化的MAT仍然具有酶活性，在乳腺上皮细胞中能够引起脂肪酸代谢基因网络的变化，但作为FASN的一个功能域，单独表达MAT并不能影响乳腺上皮细胞短、中链脂肪酸的组成。推测MAT需要与FASN的其他功能域形成复合体之后才发挥调控短、中链脂肪酸形成的作用。MAT对羊奶短、中链脂肪酸的代谢调控机制仍需要进一步的研究。