胆固醇代谢产物Triol作为内源性神经保护因子的发现及其作用机制研究

兴奋性氨基酸受体介导的信号转导决定着神经系统一系列重要的生理学和病理学过程。但至今未找到对该受体信号系统进行精确调节的内源性负性调节物。申请者前期研究发现，胆固醇代谢产物胆甾烷三醇（Triol）对谷氨酸诱导的兴奋性毒性和脊髓缺血损伤有保护作用，在转NR1/NR2B的HEK-293细胞上剂量依赖地对抗NMDA介导的细胞内钙流[Ca2+]，提示其保护作用由NMDA受体介导（见工作基础）。本项目拟通过单通道电生理及激光共聚焦细胞内钙浓度测定、放射性配体受体结合试验、配体受体共结晶，从功能水平、细胞水平和分子水平阐明Triol对NMDA受体亚型的选择性，并用缺血性预处理模型证明Triol的生理学意义。最终揭示Triol作为内源性负性调节物调控NMDA受体的信号转导过程，为甾体小分子生理功能研究开辟新领域，并为发展以此类小分子为基础的神经保护剂提供理论与实验依据。

NMDA型谷氨酸受体过度兴奋是中枢神经系统神经元死亡的重要原因。然而，机体对这些受体的生理调控机制并不清楚。本项目研究发现，胆固醇主要代谢产物胆甾醇-3β,5α,6β-三醇（Triol）是一种内源性的神经保护剂，它通过负性调节NMDA受体起到生理性的神经保护作用。我们用LC-MS建立血浆和组织中Triol的测定方法，测得人和兔血浆中Triol浓度分别为0.37µM和0.12µM。大鼠血浆和组织中Triol浓度范围为0.37~1.07µM，证实其作为一种内源性小分子而存在。在中枢神经元（脊髓运动神经元、大脑皮层神经元和小脑颗粒神经元）暴露于高浓度谷氨酸前用Triol预处理，可呈浓度依赖性地显著增加神经元的存活率。在缺血前给予Triol能显著提高脊髓缺血兔的神经功能评分（2.50vs0.83）。在短暂性大鼠中脑动脉栓塞缺血模型中，大鼠缺血后4h，Triol仍具有显著的神经保护作用。证实Triol在体内外多个细胞及整体动物模型上有显著的神经保护作用，时间窗至少为4h。接着我们用兔缺血预处理模型探讨预处理后机体产生的神经保护作用与Triol内源性浓度的关系。结果表明，缺血预处理后2~6h，内源性Triol显著升高，并在4h达高峰，大约是sham组的4倍。并且，兔经静脉注射8mg/kg Triol后2~8h脊髓中Triol含量与缺血预处理后内源性Triol升高的浓度相当(1.1~1.3 µM)。在缺血预处理前给兔注射Triol的生物合成抑制剂，缺血预处理的神经保护作用及内源性Triol浓度的上调被抑制。此外，生理浓度的Triol能降低大脑皮层细胞以及转染了NR1A/NR2B 核表达质粒的HEK293细胞中的NMDA电流。[3H]Triol在小脑颗粒神经元上能浓度依赖性地替换[3H]MK-801与NMDA受体的结合。均说明Triol的神经保护作用与直接阻断NMDA受体相关。提示Triol作为体内神经保护作用的功能性小分子，可能对中枢神经系统疾病的治疗提供新思路。除以上主要研究结果，我们也1）首次发现牛黄及其中成药以及人结石中存在包括Triol在内的多种氧化甾醇，其中Troil和7-羟基胆固醇可能是牛黄中具有神经保护作用的主要有效成分；2）首次发现Triol通过负性调控电压门控钠通道抑制癫痫发作。