长链非编码RNA 对草酸钙结晶肾损伤EMT调控机制的研究

Patients with kidney stone, after releasing obstruction，have more risk of being renal failure when comparing with normal people，but the mechanism of formation of kidney stone and its damage to kidney are still uncertain. Our previous research has demonstrated that in the early period of kidney stones formation, appears EMT on tubular epithelial cells in crystalline kidney injury period ,which start up the process of renal fibrosis. Long non-coding RNA can play a regulatory role in the development of tumor cell migration and development of EMT, but it hasn't make out that whether or not it has involvement and adjustment of EMT on tubular epithelial cells when induced by crystallization. The preliminary study using gene chips and biology information technology to set up target lncRNA CHCHD4P4, and verify that it involves in the regulation of EMT of renal tubular epithelial cells when induced by calcium oxalate monohydrate crystallization.Over this fundamental, we will further explore the expression of its transcription factor upstream and target gene downstream. Meanwhile, we will use sglt2-GFP transgenic mice to improve verification in vivo. At last,we will use clinical specimens to evaluate the possibility of using CHCHD4P4 as a biomaker to post evaluation renal function decline in patients with stones.

肾结石患者解除梗阻后肾衰的风险较正常人群增大，而肾结石形成及所致肾损伤的作用机制仍不明确。我们的前期研究证实结石形成的早期阶段，结晶性肾损伤时期小管上皮细胞即出现EMT的现象，启动了肾纤维化的进程。长链非编码RNA能在肿瘤细胞的迁移、EMT的发生发展过程中发挥调控作用，其是否参与调控结晶肾损伤小管上皮细胞EMT的发生与发展还不清楚。本研究前期采用基因芯片及生物信息技术确立目标lncRNA CHCHD4P4 ,并验证其参与调控一水草酸钙结晶诱导的EMT的发生。以此为基础，我们将进一步探索其上游的转录因子及下游的靶基因表达情况，并利用sglt2-GFP转基因小鼠进一步完善体内实验的验证，同时利用临床标本评价lncRNA作为结石患者后期将出现肾功能下降的预警标志物的可行性。

泌尿系结石所致的梗阻性肾病已经成为慢性肾脏病的主要病因之一，我们团队的前期研究提示，在结石形成的早期阶段结晶性肾病时期，肾小管上皮细胞出现向间质细胞转化（EMT），此现象的发生可能是使该类患者进展为慢性肾衰的原因之一，近年来的研究显示长链非编码 RNA 在基因表达调控的各个层面发挥作用。本文拟探究长链非编码 RNA 是否参与草酸钙结晶肾损伤 EMT 的发生与发展，明确长链非编码 RNA 在结晶性肾损伤 EMT 发生发展中的调控机制，以期在基因调控层面为临床防治晶体性肾病所致的肾损伤，降低结石患者的肾衰风险提供理论依据。.[目的]筛选出一水草酸钙结晶肾损伤细胞模型中差异表达的 lncRNAs，对其分析后明确与EMT相关的lncRNA，并对差异表达的mRNAs行GO分析及Pathway分析。利用RT-PCR验证确定目标lncRNA SPANXA2-OT1后，观察长链非编码RNA SPANXA2-OT1对一水草酸钙刺激后的HK-2细胞EMT发生和发展的调控效应，并对其机制进行探讨。.[方法]1.利用基因芯片对3组COM（一水草酸钙）刺激后的HK-2细胞及3组正常对照的HK-2细胞进行差异lncRNAs及mRNAs的筛选，将筛选出的差异表达的mRNAs做基因功能分析（GO）及信号通路分析(KEGG Pathway)； .2.确定目标lncRNAs后我们通过 RT-PCR 验证目标lncRNAs 的表达情况。同时利用干扰和过表达实验验证目标lncRNA对一水草酸钙刺激后的HK-2细胞EMT发生和发展的调控机制。.[结果]1.采用聚类分析热图发现差异表达的lncRNAs及mRNAs; GO分析提示差异表达的 mRNAs 有参与细胞的移行和迁移，Pathway 分析提示 HK-2 细胞在COM刺激后在细胞外基质受体间的相互作用、小管功能及能量代谢方面的通路被激活。经.RT-PCR 验证后筛选出lncRNA SPANXA2-OT1差异倍数较高，同时利用 lncRNA 的小干扰 RNA、过表达病毒及 miRNA 的抑制剂、模拟剂去探讨验证 lncRNA 与miRNA、mRNA 之间的关系，并研究其对肾小管上皮细胞 EMT 及增殖、凋亡的影响。同时利用双荧光素酶报告基因实验验证 miR-204 与 lncRNA SPANXA2-OT1 及 Smad5均能结合。.[结论]lncRNA S