MAPK/mTOR/IR/IGF-1R信号通路与清心开窍方对双转基因小鼠脑内SP形成作用及机制

Alzheimer，s disease（AD）is an old people common illness. The use of Western medicine have side effects great, Rehabilitation therapy is expensive, Chinese medicine treatment is very experienced. AD pathological characteristics is senile plaque（SP）,The core components is amyloid beta protein（Aβ）,The recent researches have found the mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway, insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) signaling pathway is closely related to. This project study the mechanism of MAPK/mTOR/IR/IGF-1R signaling pathway and Qingxin Kaiqiao prescription on the formation of SP of double transgenic mice.Using RT-PCR and WB determination of cortical and hippocampal GSK-3β, CDK5, ERKs, JNK, p38MAPK, Akt, IR, IGF-1R and other changes. Using immunofluorescence staining observation of senile plaques. By in vitro cell experiments, study of Qingxin Kaiqiao prescription against cell damage to explore the therapeutic mechanism of AD. The prescription is stemmed from “Fu Man Jian” in《Complete Works of Zhang JingYue》edited Zhang JingYue was Ming Dynasty famous doctor. There are effects of removing pathogenic heat from the heart、cooling the blood and inducing resuscitation. Apply clinically, the curative effect is notable. Have not seen others news report about the “Fu Man Jian” experiment studies.

阿尔茨海默病（AD）是老年常见病。西药副反应大，康复疗法价格昂贵，中医治疗经验丰富。AD病理特征是老年斑（SP），其核心成分为β-淀粉样蛋白（Aβ），近几年的研究发现其与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路、胰岛素受体（IR）和胰岛素样生长因子受体1（IGF-1R）信号通路关系密切。本项目研究MAPK/mTOR/IR/IGF-1R信号通路与清心开窍方对双转基因小鼠SP形成的作用及机制。采用RT-PCR和WB测定皮层和海马GSK-3β、CDK5、ERKs、JNK、p38MAPK、Akt、IR、IGF-1R等变化，免疫荧光染色法观测SP，体外细胞实验，研究清心开窍方抗细胞损伤的作用，探讨该方治疗AD作用机理。本实验用方源自明代著名医家张景岳《景岳全书》中的“服蛮煎”，有清心凉血开窍功效，临床运用疗效显著。关于服蛮煎的实验研究未见他人报道。

阿尔茨海默病是一种与年龄相关的神经退行性疾病。其主要病理特征包括由Aβ异常聚集而成的老年斑（SP）沉积，神经纤维缠结，和神经元的丢失。越来越多的证据证明Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化，故抑制Aβ的生成被认为是AD的潜在治疗策略，近几年的研究发现其与MAPK、mTOR、IR、IGF-1R通路关系密切，故本项目主要研究MAPK/mTOR/IR/IGF-1R信号通路相关因子与SP形成机制的关系及清心开窍方（QKF）的治疗作用。.本研究分为体内体外实验两部分。体内实验：水迷宫实验显示QKF改善了APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力；IR和IGF-1R介导下游信号途径影响Aβ的代谢过程，主要包括PI3K/AKT和MAPK信号途径，通过WB、PCR和免疫组化实验对该通路上相关分子的检测，发现与模型组相比，QKF治疗组IRS1、GSK-3α、βAPP、Aβ表达减少，IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT表达增加；mTOR 信号通路的调控在神经元发育中起重要作用,通过WB实验对该信号通路上相关分子的检测，发现与模型组相比，QKF治疗组p-AMPK表达增加，p-mTOR、p-S6K、Bace1、NeuN表达降低；MAPK信号通路在细胞凋亡中起重要作用，通过WB实验对该信号通路上相关分子及凋亡相关蛋白的检测，发现与模型组相比，QKF治疗组Bax、p-p38MAPK、p-JNK表达下降，Bcl-2、p-ERK1/2表达增加；硫磺素及银染色结果显示QKF减少SP的表达；Nissl及HE染色显示QKF促进小鼠神经元的再生；TUNEL染色显示QKF减少小鼠脑中的细胞凋亡；透射电镜显示QKF治疗改善小鼠脑中神经元超微结构。体外实验：原代神经元细胞中，MAP2染色显示QKF减少Aβ对细胞形态的破坏；CCK8法显示QKF提高了细胞活力；TUNEL染色显示QKF减少神经元细胞凋亡；WB实验发现与模型组相比，QKF组p-tau、GSK-3β、βAPP、Aβ、Bax、p-p38MAPK、cleaved caspase-3表达下降，p-Akt、Bcl-2表达增加。PC12细胞WB实验显示与模型组相比,QKF增强IGF-1R的表达，提高p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的比值。清心开窍方可能通过MAPK/mTOR/IR/IGF-1R信号通路中抑制SP形成，发挥抗AD功效。