促凋亡蛋白Bax泛素化位点的鉴定及其功能研究

Apoptosis in mammalian cells is regulated through two major pathways：the extrinsic pathway and the intrinsic signaling pathway. The intrinsic pathway is governed by the Bcl-2 family proteins. Among the Bcl-2 members, Bax plays a central role in mitochondria-dependent apoptosis, and it can inset into the mitochondrial outer membrane, leading mitochondrion-dependent apoptosis. It has been reported that the protein expression level of Bax is regulated by ubiquitin/ proteasome, and the Bax ubiquitination plays an important role in the regulation of apoptosis. So far, the mechanism of Bax ubiquitination is still unclear. In addition, the ubiquitin sites of Bax is unknown. In this study, we are planned to identify the ubiquitination sites and investigate its functional role in apoptosis and the potential application for cancer therpy.

细胞凋亡在哺乳动物细胞中主要有两个途径：外源途径以及内源途径。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡内源途径中重要的调节因子。在Bcl-2蛋白家族调节凋亡的过程中，Bax处于调节的一个中心位置，它能直接作用于线粒体外膜，从而诱发依赖于线粒体的凋亡。相关研究已表明Bax的蛋白水平受到泛素化/蛋白酶体系统的调节，其泛素化修饰在细胞凋亡调节中起着重要的作用。目前关于Bax泛素化调节的具体机制尚不明确，此外关于Bax上与泛素化有关的功能区的研究较少而且具体的泛素化关键性位点尚不明确。了解具体的泛素化位点对Bax的泛素化调节机制的研究具有重要的作用。本课题拟利用定点突变的手段鉴定促凋亡蛋白Bax上泛素结合的关键性位点，并研究相关位点对Bax促凋亡活性的影响以及对肿瘤治疗的意义。

Bax 是重要的促凋亡蛋白，已有文献报道在前列腺癌和慢性淋巴性白血病中 Bax 蛋白水平受到泛素化的调控而明显降低，使其对化疗药物产生明显抗性从而导致预后不良，所以对Bax 的泛素化调控机制的研究将有利于解决肿瘤治疗中耐药性产生这一关键性问题。本项目要解决的中心问题就是鉴定 Bax 上关键性的泛素化位点并研究其在细胞凋亡和肿瘤治疗中的作用和意义。本项目发现了K21、K123是Bax的关键泛素化位点，并且K21对Bax泛素化过程中的作用更为明显，K21、K123同时突变能显著的延长Bax蛋白的半衰期。此外，本项目在细胞水平上探讨了泛素结合位点突变后，Bax的促凋亡能力是否发生变化。经过TRAIL处理后，Bax-K21R/ K123R 细胞的凋亡率与Bax-WT相比有明显增加。同时在Xenograft肿瘤模型也显示，Bax-K21R/ K123R双突变对TRAIL最为敏感。这些结果表明，Bax K21突变对Bax促凋亡活性有显著性影响，可以使HCT116细胞增加对TRAIL的敏感性。此外，当Bax-K21R/K123R双突变后，ABT-737和TRAIL诱导的Bax降解也被完全抑制。以上结果进一步说明了K21及K123为Bax上关键性的泛素化位点。本项目鉴定了两个Bax上关键性的泛素化位点，并在细胞及个体水平上研究了其对TRAIL诱导的细胞凋亡活性的影响。基于研究结果还提出了一个Bax泛素降解的模式假说。本项目的研究结果可为Bax泛素化调节机制的深入研究夯实基础并为减少TRAIL的耐药性的研究提供新的思路，此外还可以为其它肿瘤治疗中的耐药性问题提供参考。