多粘类芽孢杆菌多粘菌素分泌途径中ABC转运蛋白的鉴定及其功能位点研究

Paenibacillus polymyxa as a plant growth promoting rhizobacterium (PGPR) can control some phytopathogens and promote the crop growth. The synthesis and secretion of lipopeptide antibiotics (eg, polymyxin) is one of the important factors for its biological control. The secretion of polymyxin is one of the key steps for the polymyxin production, but its secretion pathway is unclear. Our preliminary results showed that the RNA expression levels of six ATP-binding cassette (ABC) transporters, including PmxC, display direct correlation with the polymyxin yield, by the transcriptome sequencing analysis of polymyxin overexpressing strain and the polymyxin non-producing mutant. Based on these studies, we now focus on the function study of ABC exporters for their possible roles in the polymyxin secretion. First, identifying the ABC transporters which could export polymyxin and analyzing their transport activity, by gene knock out and overexpression technology. Moreover, a strain with low polymyxin production will be obtained. Second, by generating the homology model of PmxC and polymyxin transport docking, the structural active sites and function domains for polymyxin recognition and transmembrane transport of PmxC will be characterized. Finally, the PmxC is designed to increase the transport efficiency by combining some active sites. Our results may illustrate the important secretion mechanism of polymyxin, meanwhile, providing the foundation and scientific guide to enhance the biocontrol efficiency of P. polymyxa by optimizing the secretion pathway.

多粘类芽孢杆菌是一株植物根际促生细菌，对多种作物具有防病促生作用。多粘菌素等脂肽类抗生素的合成和分泌是其发挥生防功能的一个重要原因。多粘菌素的分泌是影响其产量的关键环节之一，但分泌途径尚不明确。我们前期研究中，通过对多粘类芽孢杆菌的多粘菌素上调菌株和不产多粘菌素突变株的转录组测序分析，得到包括PmxC在内的6个腺苷三磷酸结合盒（ABC）外排蛋白，其表达量和多粘菌素产量直接相关。以此为基础，本项目拟深入研究多粘类芽孢杆菌分泌多粘菌素的ABC转运蛋白的功能。首先，通过基因敲除和回补，明确具有分泌多粘菌素功能的ABC转运蛋白，并构建多粘菌素分泌下调工具菌。然后，结合同源模建和分子对接技术，重点解析PmxC识别和运输多粘菌素的结构基础和功能位点。最后，多个功能位点组合增强PmxC的转运能力。本课题将揭示ABC转运蛋白分泌多粘菌素的重要机制，并对优化分泌途径提高多粘类芽孢杆菌的生防功效提供理论依据。

多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌（PGPR），对多种作物具有防病促生作用。多粘菌素的合成和分泌是其发挥生防功能的一个重要原因，但多粘菌素的分泌途径尚不明确。另外，多粘类芽孢杆菌的基因表达系统尚未建立，制约了其基因功能的研究。本研究，在多粘类芽孢杆菌SC2-M1中筛选获得了P04420等不同表达特点的内源启动子，建立了基因超表达系统，为转运蛋白的鉴定提供分子工具。在菌株SC2-M1中分别敲除ABC型外排转运蛋白PmxC、PmxD、HetA、YwjA、YhcI/YhcH和BcrA3/BcrB3的结构基因，结合基因回补，鉴定出多粘菌素分泌表型相关的ABC型转运蛋白PmxC、PmxD和YwjA，其中，PmxC和PmxD的转运能力较强，YwjA还与菌株对多粘菌素的胁迫应答有关。在菌株SC2-M1中共敲除转运蛋白PmxC和PmxD，多粘菌素分泌显著降低，所得菌株SC2-M1-Δpmx为多粘菌素分泌下调工具菌。在工具菌中分别回补以及共回补PmxC和PmxD都可以部分恢复菌株的多粘菌素外排能力，推测PmxC和PmxD主要以同型二聚体发挥功能。用结构建模和分子对接等方法预测PmxC和PmxD运输多粘菌素过程中的关键活性位点和功能模块，并采用定点突变和组合突变的方法验证（以PmxD为代表）。目前发现E137、K383等单位点以及一段保守序列GDLLSRVNND（G123-D132）是PmxD分泌多粘菌素的关键位点及功能模块。目前获得了多粘菌素分泌活性提高的两个正突变体PmxD（Y394A）和PmxD（E476A）。本研究揭示了ABC型转运蛋白分泌多粘菌素的重要机制，并对优化分泌途径提高多粘类芽孢杆菌的生防功效提供了理论依据。另外，拓展研究了膜蛋白在耐受多粘菌素过程中的重要作用；并初步解析了多粘类芽孢杆菌等芽孢菌对植物的防病促生功能及其互作机制，为芽孢菌在微生物肥料领域的生防应用提供依据。