年龄相关性白内障αA晶状体蛋白磷酸化位点鉴定及其功能研究

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，调控着信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞生物学过程。晶状体蛋白磷酸化与去磷酸化的过程在维持晶状体正常生理功能中发挥重要作用，而αA晶状体蛋白磷酸化在年龄相关性白内障（ARC）发病中的作用机制不明。本项目拟采用ARC和人透明晶状体为研究对象，采用质谱成像技术进行空间定位，以iTRAQ技术进行定量分析，运用二氧化钛技术富集磷酸化肽段结合LC-MS/MS鉴定αA晶状体蛋白的磷酸化位点，在人晶状体上皮细胞株中利用基因定点突变技术模拟磷酸化与去磷酸化研究αA晶状体蛋白特定位点磷酸化对靶蛋白的作用，在原代培养的人晶状体上皮细胞中研究αA晶状体蛋白磷酸化对细胞增殖和凋亡的影响，从而初步阐明某些特定αA晶状体蛋白磷酸化位点的功能，旨在揭示早期年龄相关性白内障的发病机理。并利用磷酸化具有可逆性特征，将为ARC的预防和新药开发提供新的方向。

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，调控着信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞生物学过程。晶状体蛋白磷酸化在维持晶状体正常生理功能中发挥重要作用。作为晶状体最重要的结构蛋白，αA晶状体蛋白磷酸化在年龄相关性白内障（age-related cataract, ARC）发病中的作用机制不明，既往有研究证明磷酸化修饰存在于白内障晶状体，但其作为导致白内障生成的直接因素还是白内障的继发改变，尚无研究结论。本项目拟采用ARC和人透明晶状体为研究对象，应用质谱技术鉴定αA晶状体蛋白的磷酸化位点，在人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,hLEC）株中利用基因定点突变技术模拟磷酸化，研究αA晶状体蛋白特定位点磷酸化相应的靶蛋白，以及αA晶状体蛋白磷酸化对hLEC功能学的影响，从而初步阐明某些特定αA晶状体蛋白磷酸化位点的功能。经本课题前半部分的研究，分别在ARC和人透明晶状体中鉴定得到包括αA晶状体蛋白在内多种蛋白质的磷酸化及其位点，其中多个位点在先前的研究中未见报道。在后半部分的研究中，课题组构建了αA晶状体蛋白特定位点模拟磷酸化的基因定点突变，并成功转染hLEC，鉴定得到多种与其发生作用的靶蛋白；在细胞功能学的研究中，课题组发现经αA晶状体蛋白第45位、66位和第122位丝氨酸拟磷酸化的hLEC，其抗氧化应激和抗凋亡能力均有显著提高。推测白内障发生过程中，多种途径使晶状体内氧化应激水平升高，晶状体上皮细胞发生凋亡，αA晶状体蛋白发生继发性磷酸化并对细胞起到保护作用。本课题旨在揭示早期年龄相关性白内障的发病机理，初步查明磷酸化在白内障发病及发展过程的潜在作用，为ARC的预防和新药开发提供新的方向。