基于壮、汉族caveolin-3基因外显子突变的2型糖尿病发病机制研究

caveolin-3（Cln-3）蛋白是调控肌细胞胰岛素信号途径的枢纽。国外人种Cln-3基因突变与疾病相关。研究中发现散发的T2DM病人Cln-3基因存在多处外显子变异，这些外显子突变可能改变蛋白结构和功能。一、根据遗传学研究和生物信息学分析，选取三种最有意义的突变型：募集广西壮、汉族T2DM杂合子家系各80个，测序了解所有变异位点，经相对危险度分析（HRR）和传递不平衡检验（TDT）探讨各变异型与T2DM之间是否存在连锁不平衡关系，找出有意义的突变型；对突变进行生物信息学预测，找出对产物蛋白的结构和功能有影响的突变型。二、克隆三个突变基因型，进行突变蛋白功能研究：大肠杆菌双杂交实验观察突变蛋白是否影响其与胰岛素受体等信号分子的结合力；构建质粒表达在鼠C2C12肌细胞，在胰岛素刺激下，观察突变蛋白是否影响细胞的胰岛素受体等信号分子的膜定位和表达以及葡萄糖利用。

【目的】胰岛素抵抗是2型糖尿病（T2DM）发生发展机制的基本环节之一。骨骼肌占人体总重量40%以上，如果血中葡萄糖不能被肌细胞糖摄取和利用，高糖的情况如餐后血糖的降低将受到很大影响。Caveolin-3（Cav-3）蛋白是肌细胞膜上调节胰岛素信号分子的重要环节。我们发现2型糖尿病人有较多的Cav-3基因外显子突变位点，本研究收集T2DM家系样本，筛查突变基因，经信息学分析，通过转基因等技术探讨突基因是否对肌细胞胰岛素受体信号分子和肌细胞糖代谢发生影响，从而参与T2DM的发生发展。.【方法】收集广西壮族和汉族T2DM家系样本，抽取血样，提取DNA进行PCR，送公司测序分析CAV3基因外显子序列SNPs。结合生物信息学分析筛出引起Caveolin-3蛋白质二级结构改变的K14N、P47L等突变点。以K14N突变基因为例，首先分别构建阴性对照组GFP载体（Control-GFP）、野生型CAV-3表达载体（Cav-3wt-GFP)以及K14N突变载体（ Cav-3K14N），阳离子脂质体Lipofectamine® 3000介导转染C2C12细胞，经G418筛选建立稳定表达的克隆载体，经胰岛素（INS）刺激30min后，用Western Blot技术和IF共聚焦技术鉴定Cav-3 、Glut-4等蛋白的表达情况；同时测C2C12细胞在12h、24h对葡萄糖的摄取量和36h细胞合成糖原量。【结果】胰岛素刺激下，K14N突变造成肌细胞Cav-3总蛋白表达减少，以及细胞膜的Cav-3蛋白定位减少，使其下游信号分子AKT磷酸化减少，但AKT总蛋白无明显变化，GLUT-4蛋白表达水平降低和细胞膜定位明显减少。其后测得肌细胞对葡萄糖摄取减少，糖原合成减少。【结论】K14N等突变诱导Cav-3表达降低和细胞膜定位缺失，抑制胰岛素信号通路，包括抑制AKT的磷酸化和Glut-4蛋白的数量和转运功能，从而抑制肌细胞的葡萄糖摄取和利用。因此，我们推测糖尿病人携带的Cav-3 K14N等突变可能参与T2DM发生发展的机制。（ 国内外未见除我们之外的报道。部分样本测序结果尚未返回，有待遗传学分析和统计。）