塞隆骨治疗类风湿性关节炎活性肽分离纯化与机理研究

The Myospalax baileyi bone is the first national class 1 new animal drug in china, which is the whole bone air-dried product of plateau unique animal Myospalax baileyi. The pre-pharmacodynamic experiments have fully proved that Theron bone had a very good treatment and prevention effects on rheumatoid arthritis, and had analgesic and anti-clotting effects. In our group, preliminary studies have shown that the 90% alcohol precipitation part of Myospalax baileyi bone peptide aqueous extract is the active site for treating rheumatoid arthritis. In order to fully elucidate the pharmacodynamic material basis for Myospalax baileyi bone and the corresponding mechanism, firstly, the isolation and purification of Myospalax baileyi bone peptides will be done by adopting the means such as membrane separation and column chromatography, and the structure and physicochemical properties of Myospalax baileyi bone peptides will be confirmed and analyzed by combined with ESI-MS, NMR, and etc. In addition, isolated peptide compounds will be carried out for activity screening by using in vitro cell models and animal models. Furthermore, the corresponding mechanism of the treatment of rheumatoid arthritis will be studied, which is to identify the target cells of the active peptides, and theirs effects on rheumatoid arthritis inflammatory cytokines.

塞隆骨是高原特有动物高原鼢鼠的全骨风干品。是我国建国以来第一个国家级一类动物药材，前期的药效学实验已经充分证明塞隆骨对类风湿性关节炎有非常好的治疗预防效果，且具有镇痛，抗凝血等作用。本课题组前期的研究证明塞隆骨多肽水提物90%醇沉部分是其治疗类风湿性关节炎的主要活性部位。为了充分阐明塞隆骨的药效物质基础和作用机理，本项目拟采用膜分离、柱层析等手段对塞隆骨多肽进行分离纯化，结合ESI-MS、NMR等手段对得到的多肽进行结构和理化性质分析。应用体内外细胞模型和动物模型对得到的多肽化合物进行活性筛选，在此基础上，对活性多肽进行治疗类风湿性关节炎机理研究，重点确定它的作用靶细胞和对类风湿性关节炎细胞因子的影响。

摘要：塞隆骨是高原特有动物高原鼢鼠的全骨风干品。是我国建国以来第一个国家级一类动物药材，前期的药效学实验已经充分证明塞隆骨对类风湿性关节炎有非常好的治疗预防效果，且具有镇痛，抗凝血等作用。但该药的药效物质基础及作用机理研究都属空白。本项目利用现代分离手段及药理学方法对塞隆骨药材中的主要活性成份进行了提取分离纯化及抗类风湿性关节炎活性筛选，对筛选得到的活性物质进行了机理研究。确定了塞隆骨药材中治疗RA的药效物质基础，并初步探明了该活性物质治疗RA的作用机理。项目完成了既定研究目标，科研经费使用合理。项目实施过程中发表SCI论文4篇，申请发明专利1项并获得受理。.1. 利用超临界萃取设备萃取得到塞隆骨脂溶性成份SLG-Z，并优化建立了超临界萃取工艺。对经过萃取后的塞隆骨骨粉进行了多肽提取，并利用不同分子量的超滤有机膜对塞隆骨多肽按照不同分子量进行了分段分离，分别得到S3K、S3-10、B10三部分多肽粗提物。.2. 通过体内外活性筛选发现，SLG-Z具有明显的免疫抑制及抗炎镇痛活性。S3K在体外表现出明显的免疫抑制活性，但体内实验显示其抗炎镇痛活性较弱。同时，S3K在促成骨细胞增殖方面的活性明显优于SLG-Z。.3. 采用sephadex G25、FPLC和HPLC色谱分离手段对S3K进行了分离纯化。活性筛选显示，S3K提取物中未发现具有显著免疫抑制活性的多肽提取物。但分离纯化得到的S2-2A多肽化合物具有显著的促成骨细胞增殖活性。.4. 采用HPLC二维制备色谱对塞隆骨超临界提取物SLG-Z乙酸乙酯及正丁醇萃取物进行了分离纯化。建立了高效的分离制备塞隆骨中小分子化合物的二维制备方法。分离得到9个小极性化合物和5个环肽化合物。体内外活性筛选发现环肽化合物N.1-1在抗炎镇痛及免疫抑制方面都表现出明显的活性。.5. 利用经典的炎症、疼痛和佐剂关节炎动物模型证实化合物N.1-1具有明显的抗炎镇痛及预防治疗类风湿性关节炎活性。利用OVA及CIA动物模型，从动物、细胞及分子水平确定了该化合物的作用靶细胞为T细胞和巨噬细胞。其主要作用机制为通过抑制T细胞和巨噬细胞中促炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-1β、L-12P40 和TNF-α的分泌，并促进T细胞中抗炎性细胞因子IL-4和IL-10的产生，同时能够调节CIA小鼠关节炎模型动物中Th1/Th2的平衡状态从而达