九香虫抗菌肽的分离纯化、基因克隆表达及生物活性研究

Coridius chinensis is an important medicinal insect in China and has better antimicrobial activity. This project will focus on the isolation and purification, gene cloning and expression, biological activity, and antibacterial mechanism of antimicrobial peptides (AMPs) from C. chinensis. The main objectives of the research are to obtain highly efficient new AMPs, identify their amino acid sequences and gene sequences, perform over-expression in Picha pastoris, and find out the antibacterial targets. Research contents include: C. chinensis AMPs are induced and purified, and then are identified by mass spectrometry to acquire their amino acid sequences; these AMP genes are cloned with RACE-PCR technology and expressed highly in P. pastoris; these peptides’ biological activities are detected; and antibacterial targets are investigated. The scientific issue to be resolved is to uncover mechanisms of action of C. chinensis AMPs. .Our previous preliminary research has paved the way for this project that is a new exploration of insect AMPs. C. chinensis AMPs can be developed into a new generation of highly efficient broad-spectrum antibiotics that never cause drug-resistance. This project will be helpful to exploiting new-type antimicrobial drugs and making full use of C. chinensis resources.

九香虫是我国重要的药用昆虫，具有良好的抗菌活性。本项目从九香虫中纯化抗菌肽，克隆基因并进行真核表达，检测其生物活性，探索抗菌机理。主要研究目标是：获得新型高效的九香虫抗菌肽纯品，测出氨基酸序列和基因序列；实现在毕赤酵母中高效表达；揭示九香虫抗菌肽的作用靶标。主要研究内容及拟解决的科学问题：九香虫抗菌肽的诱导、纯化，质谱鉴定获得多肽序列；克隆抗菌肽基因并进行毕赤酵母分泌表达；测定抗菌肽的生物学活性，探索抗菌作用的靶标。揭示九香虫抗菌肽的独特作用机理。.本项目有扎实预研基础，是对昆虫抗菌肽研究的新探索，对于开发新一代高效广谱、不产生耐药性的抗菌药物，以及深度挖掘九香虫资源具有重要意义。

抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽，九香虫一种重要的药食两用昆虫。本项目用PacBio第三代测序平台进行了九香虫全基因测序，并用Hi-C测序进行辅助拼接，结果表明，九香虫基因组全长1,550 Mb，包含1,8791个基因，1,418 Mb的基因组序列被定位到10条染色体上。用PacBio平台进行了九香虫全长转录组测序，得到55,021个转录本，平均长度为1,420 bp，N50长度为1,896 bp。从全长转录组数据库中，我们获得了75个抗菌肽基因。九香虫防卫素基因CcDef，其cDNA长432 bp，包含309 bp的编码区，编码102个氨基酸。CcDef前体由信号肽、前肽和成熟肽组成。同源性和聚类分析表明，成熟CcDef与红尾碧蝽防卫素具有较近的亲缘关系。基因表达模式解析显示，该基因在整个九香虫的发育过程中都有表达，特异地在脂肪体中表达。九香虫在细菌诱导36 h后，该基因的表达水平显著上调。该基因在毕赤酵母中的表达产物具有抗大肠杆菌的活性。防卫素基因CcDef1的cDNA长395 bp，包含300 bp的编码区，编码99个氨基酸。成熟CcDef1与红尾碧蝽防御素高度同源。防卫素基因CcDef2的cDNA长522 bp，包含351 bp的编码区，编码116个氨基酸。成熟肽CcDef2与红尾碧蝽防卫素具有较近的亲缘关系。九香虫被细菌诱导12 上后，CcDef2的表达水平上达到峰值。九香虫溶菌酶基因CcLys，其cDNA长883 bp，包含一个669 bp的编码区，编码222个氨基酸。同源性分析显示成熟CcLys与茶翅蝽溶菌酶的亲缘关系最近。CcLys在九香虫整个发育时期都表达，在3龄若虫中表达水平最高；在检测的组织中都表达，在脂肪体中表达水平最高。成虫被细菌诱导后，CcLys的表达水平在12 h达到峰值。溶菌酶基因CcLys2，其cDNA长1,096 bp，包含一个长672 bp的编码区，编码223个氨基酸。CcLys2属于C-型溶菌酶，与斯氏珀蝽溶菌酶的亲缘关系最近。溶菌酶基因CcLys3，其cDNA长942 bp，包含一个长423 bp的编码区，编码140个氨基酸。CcLys3与斯氏珀蝽另一溶菌酶的亲缘关系最近。该基因在毕赤酵母中的表达产物对革兰氏阳性菌具有抗菌活性。本项目是对昆虫抗菌肽研究的新探索，对于开发新型高效抗菌药物以及深度开发利用九香虫资源具有重要意义。