番石榴叶降糖活性物质分离纯化、结构鉴定与作用机理研究

Type 2 Diabetes Mellitus (DM) has rapidly increased and become a serious threat to human health in the world. Because of the side effect and failing to improve the complications of synthetic hypoglycemic drugs, nowadays more and more researchers turn to find the effective and safe functional components with anti-diabetic activity from natual products. During a screening of medicinal plants for anti -diabetes, guava leaves are shown to hold a great promise in the treatment of diabetes mellitus and its complications. In order to investigate the effect of improving insulin resistance of guava leaves, a combined in vitro assay is proposed to utilize glucose oxidase method for glucose uptake in isolated rat adipocytes treated with epinephrine. In this process, insulin is taken as a positive control drug to screening the active constituents from guava leaves and their chemical structure will be identification by advanced spectra analysis after isolation and purification. The hypoglycemic efficacy of those bioactive compounds will be confirmed in type 2 diabetic rat models. Using fat cell model, the molecular mechanisms of glucose-uptake enhancement by the active compounds will be elucidated according to the changes on the signaling proteins in the insulin signaling pathway. The results of this proposal will not only provide the scientific theories and foundation for the usage of hypoglycemic products from guava but aslo promote the development of the discipline of Functional Foods.

2型糖尿病患者的数量逐年增加，严重威胁人们健康。由于合成药物的毒副作用及难以有效改善并发症，从天然产物中寻找安全、有效、无毒的降糖活性功能成分成为国际上的研究热点。大量民间、文献记载了番石榴叶的降糖活性和改善胰岛素抵抗的作用，但其确切活性物质和具体作用机制仍不清楚。本项目拟建立降糖脂肪细胞模型，以胰岛素为对照药物，采取生物活性追踪法分离,筛选出番石榴叶中改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖转运吸收的功能成分，并鉴定其化学结构；同时在2型糖尿病大鼠动物模型和胰岛素信号通路中相关信号蛋白表达水平的变化来阐明活性单体降糖的作用机理。本研究成果将为番石榴降糖功能因子产品在2型糖尿病防治运用中提供科学的理论和依据，促进功能食品学科的发展。

番石榴叶用来预防和2型治疗糖尿病已有悠久的历史，但其确切活性物质和作用机制仍不清楚。本文以番石榴叶为研究对象，通过建立降糖脂肪细胞模型，运用活性追踪方法，对其活性成分进行分离纯化和结构鉴定；测定活性单体不同季节含量、细胞毒性和降糖活性，展开活性单体的制备性分离纯化和活性萃取物的化学成分研究；在体外细胞水平，从胰岛素信号转导通路出发，采用Western Blot法和RT-qPCR半定量法研究活性单体的降糖机理；在整体动物水平，研究了活性单体的降糖活性，并采用基于RNA-seq转录组学和iTRAQ定量蛋白质组学技术从基因、蛋白表达和生理代谢通路角度深入揭示广寄生苷的降血糖作用机理。.研究结果表明：广寄生苷、番石榴苷为番石榴叶中主要降糖活性成分，能剂量依赖性降糖、抑制肾上腺素刺激的脂肪分解且无细胞毒性。RP-HPLC结果表明两化合物在不同季节中含量差异较大，均在7月份含量最高，分别为3.332±0.134、3.405±0.124mg/g。活性单体制备性分离共得番石榴苷6.04 g，广寄生苷9.25 g。进一步对乙酸乙酯萃取物化学成分进行研究，又获得了22种单体化合物，其中含有一种新骨架倍半萜类化合物Guavacid A。体外细胞水平中，广寄生苷能够促进p-IRS-1 、p-Akt蛋白表达，促使GLUT 4向脂肪细胞膜迁移，从而促进葡萄糖的摄取；广寄生苷对GLUT4基因的转录水平无显著影响，却显著抑制PPARr表达。实验动物水平，番石榴苷和广寄生苷能显著降低糖尿病小鼠血糖、改善葡萄糖耐量，对脏器系数无明显差异，对血脂四项、胰岛素水平、脂肪变性和炎性细胞有一定的调节改善作用。广寄生苷组与糖尿病模型组相比，显著影响89个基因通路和47个蛋白通路。在PPAR代谢通路中，广寄生苷降低糖尿病小鼠血糖的作用机制与上调甘油激酶（GYK）蛋白的表达、下调脂肪酸结合蛋白（FABP）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA和蛋白的表达及细胞色素P450酶（CYP450s）mRNA和蛋白的表达有关。.本项目研究成果为番石榴叶相关降糖功能产品的开发提供了科学依据，并为黄酮类化合物降糖机制研究提供新的方向和思路。