内质网应激在颈椎后纵韧带骨化发生过程中作用及其对Connexin43和下游信号通路调控机制研究

Cervical ossification of the posterior longitudinal ligament (OPLL) is one of the most common spinal diseases and the pathogenic mechanism has not been fully understood. Our previous studies of the first project of NSFC have demonstrated that Connexin 43 regulated downstream MAPK signal pathway in the process of osteogenic differentiation of cervcial posterior longitudinal ligament cells. But this regulation was correlated with the intensity and time of mechanical strain stimulation. Our previous research has also observed that endoplasmic reticulum stress (ERS) response existed in posterior longitudinal ligament cells of the OPLL patients, and the expression of ERS receptor protein (PERK) and transcution protein (OASIS) was significantly higher. Osteogenic differentiation of posterior longitudinal ligament cells could be suppressed by PERK knockdown. In this study, we will employ the cells from cervical posterior longitudinal ligament and the mechanical strain induced osteoblastic differentiation model, to investigate the role of endoplasmic reticulum stress in the development of cervical ossification of the posterior longitudinal ligament and mechanism of regulation on Connexin 43 and downstream signal pathway. The results will also be tested in clincial tissue specimen and animal models. This research programme will provide experimental proof of ERS participation in the development of OPLL, make up regulating signal pathway of osteogenic differentation of posterior longitudinal ligament cells, and increase understanding the pathogensis of OPLL.

颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）是常见的脊柱疾患，但发病机制尚不完全清楚。课题组在前一个基金项目研究中发现缝隙连接蛋白Cx43通过下游MAPK信号通路调控颈椎后纵韧带组织细胞骨向分化，但这种调控作用与机械应力刺激的强度和时间相关。前期研究还发现OPLL患者后纵韧带组织细胞存在内质网应激（ERS）反应，ERS的感受器蛋白（PERK）和信号转导蛋白（OASIS）表达明显增高，干扰PERK蛋白表达能抑制细胞骨向分化进程。本课题拟以体外培养的颈椎后纵韧带组织细胞为研究对象，以机械应力诱导细胞骨向分化为模型，通过多种分子生物学方法对ERS在OPLL发生过程中的作用及其对Cx43和下游信号通路的调控机制进行深入研究，并通过临床组织样本和动物实验模型进行验证。该课题研究将为明确ERS参与OPLL发生过程提供实验依据，为完善后纵韧带组织细胞骨向分化信号调控机制，和深入认识OPLL的发病机理做出新的探索。

颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）是常见的脊柱疾患，但发病机制尚不完全清楚。课题组前期研究发现缝隙连接蛋白Cx43在OPLL发生过程中发挥重要作用，但其具体作用机制尚不完全明确，并且这种调控作用与机械应力刺激的强度和时间相关。此外，前期研究还发现OPLL患者后纵韧带组织细胞存在内质网应激（ERS）反应，ERS转导蛋白（OASIS）表达明显增高，干扰OASIS蛋白表达能抑制细胞骨向分化进程。.本课题通过颈椎前路手术获取颈椎后纵韧带组织，分离培养细胞并建立机械应力诱导细胞骨向分化为模型，通过多种分子生物学方法对在OPLL发生过程中（1）Cx43及其下游信号通路的作用进行深入研究；（2）进一步明确内质网应激ERS的作用及其机制；（3）深入研究内质网应激ERS与Cx43的相互调控关系。.本项目主要研究结果包括：（1）研究共收集52例OPLL患者和16例非OPLL患者，建立研究病例资料库；采用法成功分离并培养了后纵韧带组织细胞，并通过HE染色和荧光免疫染色法进行了细胞鉴定，利用Flexercell 5000应力加载系统建立了成熟的牵张应力刺激诱导细胞骨向分化模型 ；（2）在OPLL发生过程中Cx43通过激活NFκB（p65）信号通路参与颈椎后纵韧带组织细胞成骨分化和炎性反应的调控；（3）在OPLL发生过程中内质网应激ERS激活，抑制内质网应激可抑制MAPK信号通路及其细胞成骨分化；（4）PERK蛋白所介导的内质网应激ERS可在Cx43的下游通过MAPK信号通路促进细胞成骨分化。同时，ERS通过NFκB-USP9X-Cx43信号轴调控细胞成骨分化，二者之间形成不断放大的正反馈环。.该课题研究为明确内质网应激反应ERS和Cx43参与OPLL发生过程提供实验依据，为完善后纵韧带组织细胞成骨分化信号调控网路，和深入认识OPLL的发病机理做出新的探索，并可能为OPLL的药物靶点治疗及非手术治疗提供新的思路。