机械应力刺激通过connexin43诱导颈椎后纵韧带骨化细胞间信息传递的分子机制研究

The molecular mechanism of ossification of the posterior longitudinal ligament (OPLL) is still unclear. On basis of our previous work observing connexin43(Cx43)-mediated development of ligament ossification in response to mechanical stimulation, the research is prepared to culture the ligament cells of OPLL in vitro, and observe intra- and inter-celluar Ca2+ oscillation after mechanical stimulation of single cell in subconfluent monolayers is performed. The intra- and inter- cellular Ca2+ oscillation is observed again after the gap junction inhibitor Heptanol and a-glycyrrhetinic acid (AGA) is used to confirm the inhibition of gap junction communication, after the cells are switched to the high potassium medium maintaining membrane depolarization, after monolayers of OPLL cells are treated with nifedipine, an antagonist of L-type voltage-gated calcium channels, and after the bathing medium is exchanged for calcium-free medium. Through above study, it is to argue the hypothesis that under mechanical stimulation, extracellular calcium influx via L-type calcium channels is activated by membrane depolarization, leading to oscillation of intercellular calcium and transmission between OPLL cells via Cx43. This model can coordinate the consistency of cellular activity. The research discusses the signal transfer channel during OPLL cells, in order to find out novel target for conservative treatment of OPLL, and provide theoretical basis for clinical drug design and develop in interrupting the progression of ossification.

颈椎后纵韧带骨化症发病的分子机制尚不明确。本项目在我们前期工作观察到机械应力通过Cx43诱导韧带骨化进展的基础上，体外培养颈椎后纵韧带骨化患者韧带细胞，使之呈单层排列，在显微操作系统下对单个细胞实施应力刺激，观察细胞内及细胞间Ca2+浓度的震荡模式。Heptanol及AGA特异抑制Cx43缝隙连接通道，高浓度钾溶液使胞膜持续去极化，nifedipine阻断细胞膜L型电压门控钙通道，更换无钙培养基清除细胞外Ca2+，分别进行应力刺激并观察胞内及胞间Ca2+浓度震荡模式的变化。通过上述研究以论证假说：机械应力刺激下，细胞膜去极化诱发L型电压门控钙通道开放，细胞外Ca2+内流导致细胞内Ca2+浓度改变，并通过Cx43缝隙连接通道迅速在细胞间传递，协调细胞间活动的一致性。本课题研究骨化细胞间存在的信号传导途径，以期探寻颈椎后纵韧带骨化保守治疗的新靶点，为临床研发阻断韧带骨化进展的药物提供理论基础。

研究背景：颈椎后纵韧带骨化症是临床常见病，发病机制不明确。临床尚无有效的药物阻止骨化进展，手术仍然是被认为唯一有效的治疗手段，但手术风险大、并发症多，且内固定费用昂贵。因此，如何从OPLL的分子发病机制方面着手，研究骨化韧带细胞间的信号传导途径，探寻韧带骨化保守治疗的靶点，从而研发阻止骨化进展的药物受到高度关注。.研究内容：颈椎后纵韧带骨化症的发病机制尚未完全明了，目前研究认为机械应力刺激可促进颈椎后纵韧带骨化的进展，本课题组成员对体外培养的颈椎后纵韧带骨化患者的韧带细胞进行机械牵张应力刺激后发现，其细胞内骨化标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）及I型胶原（COL I）的mRNA表达量出现了明显的升高，而非后纵韧带骨化组无明显变化，证实了机械应力刺激在颈椎后纵韧带骨化进展中的促进作用。但是机械应力如何促进颈椎后纵韧带骨化的进展，细胞间信息传递的分子机制如何，涉及什么样的信号通路，国内外未见相关报道，是本项目的研究内容。.重要结果：1. 研究发现颈椎后纵韧带骨化患者的后纵韧带标本内具有软骨化及骨化组织，同时将后纵韧带骨化患者的韧带细胞培养后检测骨化标志物（骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原、Runx-2），发现较非后纵韧带骨化组有明显升高。2. 发现将地塞米松作为一种干预因素，可以诱导颈椎后纵韧带骨化患者的韧带细胞成骨化，表现为促进后纵韧带骨化患者的韧带细胞表达骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原，而对照组无明显变化。3. 研究发现颈椎后纵韧带骨化组细胞Cx43、磷酸化ERK的表达明显高于非骨化组，地塞米松诱导后Cx43的表达亦出现了明显的升高。然后采用SiRNA干扰技术抑制Cx43的表达，细胞内骨化标志物骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原及Runx-2的表达明显下降。再次给予地塞米松诱导，骨化标志物的表达亦不再升高。4. 发现SiRNA抑制Cx43的表达后，磷酸化ERK的表达亦出现了明显的下调。采用ERK特异阻断剂抑制磷酸化ERK的表达后，骨化标志物（骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原）及Runx-2的表达出现了明显的下降。.科学意义：通过本项目研究，证实了Cx43 这种缝隙连接蛋白通过ERK信号通路调节细胞Runx-2、骨钙素、碱性磷酸酶及I型胶原的表达，促进骨化的进展。为进一步阐明颈椎后纵韧带骨化的发病机制及临床研制阻断后纵韧带骨化进展的药物提供了思路。