新孢子虫转录因子AP2XII-4的鉴定及功能研究

Neospora caninum (N.caninum) are obligate intracellular parasites that can infect a wide variety of animals resulting in Neosporasis with abortions and nervous system dysfunction. It is a significant cause of abortion in dairy. According to previous studies, ROP5 is a key factor associated with N.caninum pathogenicity for mice. Meanwhile, the expression levels of many factors of ApiAP2 transcription-factor family, are increased due to the deletion mutants of ROP5, especially for AP2XII-4. We concluded that ApiAP2 factors, AP2XII-4 included,　may play an important role, but there is long-time absence of the research in N.caninum. Based on this, the main research object of the thesis is the identification and function of transcription regular factor AP2XII-4 in N.caninum. In the project, the identification of AP2XII-4 will be accomplished by bioinformatics analysis and molecular biology technology, then the function by many techniques, such as a genome-editing technique, animal experimentation and immunoprecipitation. The research of this thesis will be helpful in enriching the research of the ApiAP2 transcription regular factor, and crucial to fully clarify the mechanisms of development and pathogenesis in N.caninum.

新孢子虫（Neospora caninum）是一种专性细胞内寄生原虫，引起多种动物以生殖和神经系统功能障碍为主的新孢子虫病，是造成奶牛流产的主要病原之一。项目申请人前期研究发现新孢子虫棒状体蛋白5（ROP5）是介导虫体致病性的关键因子，且ROP5缺失导致虫体多个ApiAP2家族转录因子表达量升高，尤其是AP2XII-4。申请人推测包括AP2XII-4在内的新孢子虫ApiAP2家族转录因子在虫体生命活动中发挥重要功能，但该领域研究一直处于空白状态。基于此，申请人拟开展新孢子虫转录因子AP2XII-4的鉴定及功能研究。项目借助于生物信息学分析和分子生物学方法进行新孢子虫AP2XII-4的鉴定，继而利用基因编辑技术、动物试验和免疫共沉淀等技术对AP2XII-4在虫体生命活动中的作用展开研究。本项目的开展将丰富新孢子虫ApiAP2转录因子领域的研究，对于理清新孢子虫的发育和发病机制至关重要。

新孢子虫（Neospora canium）是一种专性细胞内寄生原虫，主要引起牛的流产和犬的神经系统机能障碍。目前为止，关于新孢子虫AP2家族因子的转录调控研究十分有限。本研究对新孢子虫NcAP2XII-4进行了鉴定及功能分析。生物信息学分析结果显示，NcAP2XII-4基因序列全长12259bp，包含一个内含子，编码基因全长11976bp，编码3991个氨基酸，分子量大小为413254.47Da。预测该蛋白定位于细胞核中，且包含AP2结构域。成功制备兔源抗NcAP2XII-4蛋白的抗体，Western blot成功检测检测到虫体表达的410KDa的蛋白。IFA结果显示细胞内新孢子虫NcAP2XII-4蛋白分布于细胞质和细胞核，细胞外的虫体NcAP2XII-4定位于细胞膜。通过CRISPR/cas9技术将NcAP2XII-4的AP2结构域缺失后发现，虫体在增殖过程中逐渐死亡，说明该基因为新孢子虫必需基因。通过DAP-Seq技术，成功筛选出NcAP2XII-4结合的motif，且EMSA实验证明了该蛋白与ROP5蛋白存在结合，且NcAP2XII-4是新孢子虫关键致病因子ROP5的上游调控因子。本研究确定了新孢子虫转录调控因子NcAP2XII-4，为清晰认识新孢子虫的发育和致病机制奠定了良好基础。