大黄酸对胰岛β细胞Drp1-Pink1/Parkin线粒体自噬通路的干预作用研究

Mitochondrial dynamic imbalance is known to contribute to progressive functional impairment and injury of islet β-cells. Although mitochondrial homeostasis is mainly determined by the balanced action between mitochondrial fission (Drp1) and fusion (mitofusin) proteins through coordinate control of mitochondrial fission and fusion, mitochondrial autophagy (mitophagy) is also involved in mitochondrial homeostasis. In addition, Drp1 is known to regulate (inhibit) mitophagy. It is important to understand whether therapeutic effect of medicine is through intervention of this process to protect β-cells. We have previously demonstrated that Rhein can prevent Drp1 upregulation, accompanied by activation of downstream molecules of Drp1, Pink1/Parkin, which is critical for mitophagy. Therefore, we propose that Rhein may promote β-cells mitophagy by preventing Drp1 upregulation and thus activating Pnk1/Parkin, thereby removing damaged mitochondria timely and protecting the cells from damage. We will utilize primary islet β cell, NIT-1 cell line, and diabetic db/db mice, and perform a variety of cellular and molecular experiments to test this hypothesis.

线粒体动力学稳态失衡是造成β细胞功能降低和损伤并诱发糖尿病的主要机制之一。虽然线粒体动力学稳态主要依赖线粒体分裂蛋白Drp1和线粒体融合蛋白mitofusin作用的平衡，但线粒体的自噬降解也是线粒体稳态调节的一个重要机制，并且同样受Drp1的调控。阐明β细胞治疗药物是否通过干预这些过程而保护胰岛β细胞具有重要意义。我们前期研究发现中药大黄酸能够抑制β细胞损伤中Drp1的表达，并伴有Drp1下游的线粒体自噬通路成员Pink1/Parkin的活化，因此提出大黄酸可能通过抑制Drp1而促进β细胞线粒体自噬，及时清除损伤的线粒体，维持线粒体稳态平衡，从而维持其正常功能并减轻其损伤。我们将利用原代β细胞、β细胞株NIT-1、糖尿病db/db小鼠等，采用多种技术手段，从细胞、分子多方面深入探讨大黄酸是否通过Drp1-Pink1/Parkin促进β细胞线粒体自噬从而保护β细胞。

线粒体动力学稳态失衡是造成胰岛β细胞损伤和功能降低并诱发糖尿病的主要机制之一。虽然线粒体动力学稳态主要依赖线粒体分裂蛋白Drp1和线粒体融合蛋白mitofusin作用的平衡，但线粒体的自噬降解也是线粒体稳态调节的一个重要机制，并且同样受Drp1的调控。阐明β细胞治疗药物是否通过干预这些过程而保护胰岛β细胞具有重要意义。我们通过体内糖尿病小鼠模型和体外培养的胰岛β细胞研究大黄酸对高糖诱导的胰岛细胞线粒体自噬、线粒体分裂及胰岛细胞功能的影响，并通过应用自噬抑制剂氯喹及慢病毒转染Drp1的方法，观察大黄酸对线粒体自噬通路Drp1/Pink1/Parkin的影响，探讨大黄酸对胰岛细胞的保护作用机制。体内实验选择四周龄db/db及db/m小鼠，连续给药12周研究大黄酸对db/db小鼠胰岛β细胞线粒体动力学、线粒体自噬蛋白、胰岛素分泌及胰岛细胞凋亡的影响。研究表明连续给药12周，大黄酸组db/db小鼠体重下降，给药第七周以后大黄酸组血糖明显降低。大黄酸组能很好的改善糖耐量实验，而给予线粒体分裂抑制剂Mdivi组葡萄糖的浓度虽在60分钟有所下降，但是无统计学差异。与db/db组小鼠比较，大黄酸组和mdivi组均能显著降低db/db小鼠Drp1的表达，增加LC3、beclin1、pink1和parking的含量。连续给药12周后db/db小鼠胰岛细胞凋亡数量明显增加，给予大黄酸组凋亡数量明显降低， Mdivi组凋亡数量也明显降低。体外细胞研究表明，胰岛细胞给予33.3mM高糖刺激后胰岛素的分泌量减少，线粒体形态从长丝状变化成圆点状，Drp1表达明显增加， LC3Ⅱ/Ⅰ,beclin1,pink1,parkin表达降低，细胞凋亡增加。而给予大黄酸后胰岛素分泌量增加，发生线粒体分裂的β细胞数量减少而融合的数量增加， Drp1表达下调，而LC3Ⅱ/Ⅰ,beclin1,pink1,parkin明显增加，β细胞凋亡减少。通过慢病毒转染Drp1于胰岛细胞，高表达Drp1对胰岛素分泌功能具有抑制作用，而低表达Drp1对胰岛素分泌敏感，可增加线粒体自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ,beclin1,pink1,parkin的表达，减轻胰岛细胞的凋亡。以上研究表明：大黄酸能通过调节胰岛细胞Drp1/pink1/parkin 信号通路增加线粒体自噬，清除损伤的线粒体，维持线粒体的动力学平衡，保护胰岛细胞功能。