致密颗粒蛋白7参与新孢子虫致病性的分子机制

Neospora caninum is an obligate intracellular parasitic protozoa. It can infect a wide range of animals. It is one of the main causes of dairy miscarriage. We found that the rhoptry protein 5 (NcROP5) was a virulence factor of Neospora caninum in our previous study. The transcription of dense granule protein 7 (NcGRA7) in NcROP5 gene knockout strain was significantly decreased and the protein localization was disturbed, indicating that NcGRA7 may be interact with NcROP5 and plays a role in pathogenicity of parasites. Our project will use Crispr/Cas9 to obtain the Neospora caninum gene control strains, and then clarify the biological characteristics of NcGRA7 in parasites reproduction, maintaining the stability of the parasitophorous vacuole, and obtaining the nutrition from the host. Screening proteins interacting with NcGRA7 by pull-down, mass spectrometry and Co-IP will allow us to explore the pathways and mechanisms of protein interaction. To explore the role of NcGRA7 in Nesopora caninum escaping from host immune killer mechanisms, we will search for immune effector factors and finally elucidate the molecular mechanism of NcGRA7 affecting the pathogenicity of Neospora caninum.

新孢子虫是一种专性细胞内寄生原虫，能感染多种动物，是造成奶牛流产的主要原因之一。我们在前期研究中发现棒状体蛋白5（NcROP5）是新孢子虫的毒力因子，而致密颗粒蛋白7（NcGRA7）在NcROP5基因缺失虫株中转录水平显著下降、胞内蛋白定位发生紊乱，提示NcGRA7可能与NcROP5相互调节，影响新孢子虫的致病性。本项目拟利用Crispr/Cas9技术获得新孢子虫基因调控虫株，阐明NcGRA7在参与虫体繁殖、维持纳虫空泡稳定性和获取宿主营养等方面的生物学特性；应用Pull-down、质谱分析、Co-IP等方法筛选与NcGRA7的互作蛋白，探讨蛋白相互作用的途径和机制；利用蛋白质组学和免疫荧光技术，找出NcGRA7调控的宿主免疫效应因子，探索NcGRA7在新孢子虫逃避宿主自主免疫杀伤过程中的作用，阐明NcGRA7影响新孢子虫致病性的分子机制。

新孢子虫是一种专性细胞内寄生原虫，新孢子虫致密颗粒分泌的致密颗粒蛋白是形成纳虫空泡的重要物质基础，为虫体在细胞内生存和繁殖创造了有利条件，其中NcGRA7就定位于纳虫空泡膜及纳虫空泡腔内。为研究NcGRA7的功能，利用同源重组和CRISPR/Cas9基因敲除技术获得基因敲除虫株ΔNcgra7，通过表型实验发现NcGRA7基因的缺失导致虫体增殖能力减弱，对小鼠的致病性减弱。但不影响新孢子虫的入侵和小分子物质进入纳虫空泡的能力。.在小鼠感染新孢子虫的先天性免疫反应中，不同基因编辑虫株均能刺激机体产生IFN-γ和IL-1β，但ΔNcgra7虫株刺激机体产生的IFN-γ和IL-1β的水平明显低于母源虫株；ΔNcgra7虫株刺激小鼠细胞免疫因子（GBP1、GBP2、IRGa6和IRGb6）的转录水平显著高于母源虫株Nc1。进一步研究发现ΔNcgra7感染巨噬细胞Raw246.7后虽不影响IRGa6的蛋白表达水平，但其向纳虫空泡膜上的聚集增多，导致巨噬细胞对ΔNcgra7虫株的清除能力增强。转录组测序及生物学分析发现，NcGRA7基因的缺失，引起新孢子虫许多基因的转录水平发生显著变化，这些差异基因主要存在于NcGRA7编码基因的转录和蛋白的泛素化修饰等生物学过程。表明NcGRA7蛋白在虫体内可能存在多种形式，与其它蛋白一起作用，参与维持虫体的生长。.NcGRA7蛋白通过影响新孢子虫自身的增殖能力和宿主细胞免疫因子的聚集能力，从而影响虫体对小鼠的致病力，说明NcGRA7在保证虫体正常繁殖及协助虫体逃避宿主免疫反应过程中发挥着重要作用，阐明了NcGRA7影响新孢子虫致病性的分子机制。为深入研究NcGRA7生物学功能及其在先天性免疫过程中的作用机制奠定了基础。