调控PINK1/parkin通路对氧化损伤后黑素细胞线粒体自噬、功能及凋亡的作用研究

Oxidative damage has been recognized as an important pathogenesis of vitiligo, supported by our previous studies that have proven oxidative stress can cause mitochondrial damage as well as apoptosis of melanocytes.The mitochondria are most sensitive in response to oxidative stress, and damage to the mitochondria is the initiating factor to apoptosis.PINK1/parkin is the main pathway that regulates mitophagy,it can remove damaged mitochondria, which is essentially important to maintain mitochondrial homeostasis .Parkinson's disease is caused by apoptosis of dopamine neurons, and progressive loss can be prevented by regulating the PINK1/parkin pathway for mitochondria, thus preventing Parkinson's disease from progressing.Apoptosis of melanocytes can cause vitiligo, hence we hypothesize: it is highly possible that PINK1/parkin pathway can regulate mitochondria of melanocyte to autophagy, reversing melanocyte apoptosis, thus impeding vitiligo from progressing. This research will involve gene silencing technology by short hairpin RNA to silence single and double genes to construct the melanocyte PINK1/parkin gene's low level expression model, which can be used to observe the effects of gene regulation on mitophagy, mitochondrial dynamics , function, and melanocyte apoptosis. By utilizing plasmic transfection technology and neuroprotectant agent NP7, we will observe whether the overexpression of PINK1/parkin can reverse the damage oxidation causes on mitochondria or not, which will stop melanocyte apoptosis.We have high hopes that this research can have new findings on vitiligo's treatment and early intervention, providing new insight to vitiligo's pathogenesis and treatment.

氧化损伤是白癜风发病的重要机制之一，我们的前期研究已证明氧化应激可致线粒体损伤和黑素细胞凋亡。氧化应激时线粒体损伤是引起细胞凋亡的始动因素。PINK1/parkin是调控线粒体自噬的主要通路，可清除受损线粒体，维持线粒体稳态。帕金森病由多巴胺神经元凋亡所致，调控PINK1/parkin通路可阻止神经元凋亡。黑素细胞也起源于神经嵴，与多巴胺神经元相似，黑素细胞凋亡可导致白癜风，据此我们提出如下假说：PINK1/parkin极有可能调控黑素细胞线粒体自噬和逆转细胞凋亡进而改变白癜风进程。本研究采用小发卡RNA单基因及双基因共沉默技术构建黑素细胞PINK1、parkin基因的低表达模型，观察下调基因后对线粒体自噬、动力学、功能及对凋亡的影响；应用质粒转染技术使PINK1、parkin过表达及加入神经保护剂NP7观察能否逆转氧化所致线粒体损伤，进而阻止细胞凋亡。本研究有望为白癜风的治疗提供新靶点。

白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，虽然其致病机制尚未完全阐明，但越来越多的研究证据显示氧化应激和免疫反应参与白癜风的发生。线粒体损伤作为细胞整体氧化损伤的关键始动因素，现已证实Nrf2通路可调控黑素细胞氧化应激。PINK1/parkin通路可介导线粒体自噬，是多巴胺神经元凋亡、帕金森病（PD）发病的重要途径。黑素细胞与多巴胺神经元共同源自外胚层神经嵴，细胞形态及生理代谢途径相似，黑素细胞凋亡参与白癜风发病，我们推测PINK1通路与黑素细胞有着密切联系。然而迄今为止，国内外尚缺乏PINK1与黑素细胞的相关报道。故本研究拟采用RT-qPCR及WB方法检测PINK1在正常人黑素细胞是否表达，并在H2O2诱导体外氧化应激模型的基础上，结合siRNA细胞转染技术，调控PINK1表达对氧化损伤后黑素细胞形态、活力及线粒体结构及功能的影响，初步探究PINK1对氧化损伤后的黑素细胞是否具有保护作用。首先分别利用实时逆转录PCR及免疫印迹的方法，明确PINK1mRNA及蛋白的表达；进而分别设计三对PINK1特异的质粒和小干扰RNA（siRNA），应用RT-qPCR方法，筛选siRNA，构建PINK1低表达模型；同时不同浓度H2O2（0-0.9mmol/L）作用于PIG1细胞24h，倒置显微镜观察细胞形态，CCK-8法测定细胞活力，确定H2O2最适浓度，建立体外氧化损伤模型；而后细胞转染48h后，加入最适浓度H2O2继续处理24h，进行一系列实验观察及检测，包括倒置显微镜观察各组细胞形态，CCK-8法测定细胞活力，流式分析细胞凋亡、细胞内ROS水平、线粒体膜电位及线粒体通道转运孔开放情况，透视电镜观察黑素细胞及线粒体超微结构。实验结果显示PINK1在正常人黑素细胞中有表达，且下调PINK1表达后，细胞凋亡增加、细胞活力明显下降、、细胞内ROS明显增加、线粒体膜电位明显降低以及线粒体膜通道转运孔（MPTP）开放明显增加，推测PINK1对黑素细胞尤其是线粒体有一定的保护性作用。综合上述结果，本研究为探讨PINK1通路对氧化损伤后黑素细胞线粒体自噬、功能的影响及其可能的作用机制奠定了坚实的基础，本研究有望为黑素细胞研究尤其是对黑素细胞的保护研究及相关机制提供新靶点和新思路。