蟾毒灵靶向糖酵解途径抗STRO1+/CD117+骨肉瘤肿瘤干细胞机制研究

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor in adolesent, the recurrence and metastasis still challenge the oncologists. Recently, numerous researches demonstrate that the tumor stem cell is the origin of recurrence and metastasis. Our preliminary data showed bufalin possessed a strong anti-tumor effect on STRO-1+CD117+ osteosarcoma stem cell.Further,we found TPI1 and Enolase 1, the key enzymes in glycolysis, were significantly down-regulated following bufalin treatment,however,the molecular mechanism and the in vivo the anti-tumor stem cell effect of bufalin is still unclear. Therefore, the present study will use more cell lines and animal model to validate the anti-tumor stem cells effect in vitro and in vivo; detect the index of glycosis and combining with the clinical data to assess the value of TPI1 and Enolase 1 as the therapeutic targets; employ variety of biological assays to elucidate the mechanism of bufalin anti-tumor stem cell effect. This study will deepen the knowledgement of the bufalin anti-tumor stem cell effect,elucidate the importance of glycosis in the treatment of osteosarcoma and provide a new therapeutic strategy of osteosarcoma.

骨肉瘤是青少年最常见原发恶性骨肿瘤，复发、转移仍是当前临床治疗难题。近年来研究表明肿瘤干细胞是肿瘤复发及转移的根源。我们前期研究发现蟾毒灵对STRO-1/+CD117+骨肉瘤肿瘤干细胞具有显著杀灭效果，进一步通过蛋白质组学筛查证实蟾毒灵处理后胞内糖酵解途径关键酶α烯醇化酶（Enolase1）和磷酸丙糖异构酶-1（TPI1）表达明显下调，然而目前糖酵解在蟾毒灵抗骨肉瘤肿瘤干细胞中的作用及其机制尚未阐明。现拟在前期基础上利用多种细胞、动物模型验证蟾毒灵体内外抗骨肉瘤肿瘤干细胞的作用；检测细胞耗氧量、糖酵解指数等能量代谢指标，探索糖酵解关键酶Enolase1、TPI1作为抗骨肉瘤肿瘤干细胞治疗靶点的价值；通过转染、干扰等方法阐明糖酵解途径在蟾毒灵抗骨肉瘤肿瘤干细胞中的意义。本项目将深化对蟾毒灵抗骨肉瘤肿瘤干细胞的认识，揭示糖酵解途径在蟾毒灵抗骨肉瘤肿瘤干细胞中的作用，为骨肉瘤治疗提供新的策略。

骨肉瘤是全身骨骼系统最常见的恶性肿瘤，主要发生于青少年，恶性程度高，危害大。随着新辅助化疗、广泛切除外科技术的应用，骨肉瘤患者五年生存率提高到50-60%左右，但仍有40％左右的骨肉瘤患者因对化疗药物不敏感发生复发或肺转移。因此，开发有效治疗靶点，寻找抗骨肉瘤的新型药物，可能成为改善骨肉瘤预后的一种有效手段。本项目通过体外细胞实验、糖酵解代谢产物和干细胞标志物检测、动物体内PDX模型等方法，发现蟾毒灵可以抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导骨肉瘤细胞凋亡，并通过靶向抑制糖酵解途径关键酶PKM2，减少骨肉瘤细胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，对骨肉瘤细胞糖酵解途径具有显著抑制作用；同时，蟾毒灵可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤球能力，下调干细胞标志物CD133和NANOG的表达水平，显著抑制骨肉瘤细胞的干性特征；进一步，蟾毒灵在动物体内PDX模型中同样具有良好的治疗效果，蟾毒灵治疗组动物肿瘤体积和重量明显小于对照组，且无明显毒副作用；另外，通过qPCR和免疫组化检测，发现PKM2在骨肉瘤组织中明显上调，并与骨肉瘤患者的临床预后显著相关，提示PKM2可能成为骨肉瘤诊断和预后判断的潜在分子标志物。综上所述，蟾毒灵在靶向抑制肿瘤干细胞和糖酵解途径方面具有显著效果，并具有良好的体内外抗骨肉瘤作用，临床转化价值较高，有望开发成为骨肉瘤治疗的新型药物；同时本项目还通过对肿瘤干细胞和肿瘤代谢方向的研究，为骨肉瘤新型药物开发提供了新的策略和思路。