miR-26a/GSK-3β/NF-κB信号网路调控骨肉瘤干细胞的实验研究

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor with poor prognosis and unclear pathogenesis.Studies indicate that osteosarcoma stem cells drive osteosarcoma initiation and progression. Therefore,it's of great importance to further study its tumorigenesis and to identify new therapeutic targets.We found that miR-26a directly regulated GSK-3βwhich was an oncogene positively activating NF-κB transcriptional activity to promote tumorigenicity.The present study aims to:(1)adopt microfluidic chips,flow cytometry,lentivirus system reprogramming and in vivo imaging system to study the role of miR-26a/GSK-3β/NF-κB pathway in regulation of osteosarcoma stem cells and reprogramming of MSC to osteosarcoma stem cells and also to assess its clincal value;(2)adopt tissue array to confirm the interactive regulation among components of the pathway and its correlation with clinical prognosis. Also, real time quantitate chips are used to determine whether miR-26a in plasma can serve as a feasible diagnostic factor in clinic.The present study will bring new understanding and concept to the initiation and progression of osteosarcoma and to the multi-disciplinary therapy of osteosarcoma.

骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤，预后差且发病机制不清，研究显示骨肉瘤干细胞起始骨肉瘤形成和进展，因而深入研究其成瘤机制并鉴定新的治疗靶点非常必要。我们前期试验发现miR-26a直接调控GSK-3β，而后者在骨肉瘤为癌基因，可正向调控NF-κB转录活性而促进骨肉瘤细胞成瘤。本项目拟进一步：（1）采用微流控技术单细胞水平检测、流式细胞技术、慢病毒调控系统重编程以及体内成像系统等生物手段，在多种原代细胞、裸鼠移植瘤模型及血液和组织标本中逐级纵向阶梯式验证miR-26a/GSK-3β/NF-κB信号环路调控骨肉瘤干细胞并促进骨髓间充质干细胞重编程为肿瘤干细胞的关键性作用及其临床应用价值；（2）组织芯片确认该环路各组分调控关系及其与临床预后相关；实时定量芯片评估血浆miR-2a可否作为临床早诊断的指标。本项目的完成，为骨肉瘤的起始、进展和综合治疗提供新认识和思路，最终为改善骨肉瘤预后带来新的临床策略

骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤，好于儿童和青少年，早期极易发生肺转移。研究认为，骨肉瘤是间充质干细胞向成骨细胞分化障碍引起的恶性疾病，而肿瘤干细胞则是肿瘤复发和转移的根源。在本课题中，我们成功利用成瘤球培养，化疗药物富集以及ALDH酶活性等筛选方法分离骨肉瘤干细胞，并且发现成骨相关miR-26a在骨肉瘤干细胞中的表达明显低于非干细胞，提示miR-26a表达缺失可能与骨肉瘤干细胞特性维持有关。在骨肉瘤细胞中过表达miR-26a能降低骨肉瘤细胞的成瘤球能力以及ALDH阳性细胞的比例，OCT3/4、NANOG、SOX2等干细胞标记的表达水平也明显降低。此外，我们还发现过表达miR-26a还能降低骨肉瘤细胞在体外的增殖能力以及对阿霉素的耐药性；动物实验也证实miR-26a能抑制骨肉瘤细胞体内成瘤能力以及增加骨肉瘤细胞对阿霉素的化疗敏感性。生物信息学软件（microRNA.org和TargetScan）预测发现miR-26a能靶向结合JAG1（编码Jagged1）的3’UTR区域，RT-PCR检测显示miR-26a 与JAG1在骨肉瘤细胞和组织中表达成负相关关系。荧光素酶报告实验提示miR-26a能通过靶向结合JAG1的3’UTR而调控其转录活性。Jagged1是Notch信号通路的一种配体，我们的功能实验结果证实miR-26a能通过靶向Jagged1/Notch通路活性抑制骨肉瘤细胞的干性特征和体内成瘤能力。最后，我们应用原位杂交技术发现miR-26a低表达与骨肉瘤患者的肺转移与不良预后相关。综上所述，我们得出以下结论：miR-26a在骨肉瘤干细胞中表达缺失，miR-26a在骨肉瘤细胞的表达能抑制其干细胞特性；miR-26a能在体内外抑制骨肉瘤细胞的生长和对阿霉素的化疗抵抗；miR-26a在骨肉瘤细胞中能通过调控Jagged1/Notch信号通路发挥抑癌作用；miR-26a表达与患者肺转移和不良预后密切相关。由此可见，miR-26a在骨肉瘤进展中发挥了重要作用，靶向干预miR-26a和Notch信号通路将有助于抗骨肉瘤的治疗。