基于P-gp途径研究蟾毒灵逆转结肠癌多药耐药的分子机制

Multidrug resistance is one of the most formidable challenges in the field of cancer chemotherapy. P-glycoprotein belongs to the large ATP-binding cassette transporter superfamily of membrane tranporters and mediates resistance to a variety of anticancer drugs. In our previous study, we found that bufalin, a major bioactive component isolated from the skin and parotid glands of venenum bufois, could inhibit P-gp expression and induce apoptosis in colon cancer cells. Thus we hypothesize that bufalin, a potential P-gp inhibitor, act as a sensitzer in anti-cancer chemotherapy. On this hypothesis, the present project designs to investigate the effect of bufalin on cellular P-gp-ATPase activity, P-gp localization and expression. P-gp-mediated drug active transport will be investigated by using fluorescent probe, transport assay, HPLC technique, RT-PCR and Western blot in Lovo and Caco-2 cells. Moreover, the influences of bufalin on cell apoptosis and proliferation mediated by multidrug resistance molecule P-gp/MDR1, and the related signaling molecules such as MAPK (p38-MAPK, ERK, JNK), and P13K/AKT were investigated by mean of immunohistochemistry, RT-PCR, Western blot in murine xenograft model. This project will provide the experimental and theoretical evidences and new treatment strategies for the clinical application of bufalin in therapy of colon cancer.

多药耐药是导致肿瘤化疗失败的关键因素，P-糖蛋白（P-gp）是产生耐药的主要靶分子之一。我们前期发现中药蟾酥中活性成分蟾毒灵能够通过抑制P-gp的表达，从而促进结肠癌细胞凋亡。提示蟾毒灵可能作为一种P-gp抑制剂，通过协同其它化疗药，增强抗肿瘤疗效。鉴此，本项目应用膜转运功能测定、荧光标记、HPLC等观察蟾毒灵对肿瘤细胞P-gp-ATPase、P-gp在细胞膜与核上的定位与表达、P-gp介导药物转运等影响，阐明蟾毒灵抑制P-gp介导的药物外排机制。应用Western blot、RT-PCR、免疫组化等观察蟾毒灵对小鼠移植瘤模型P-gp介导的细胞凋亡和肿瘤生长的作用；并研究蟾毒灵对相关信号分子如JNK、ERK、p38-MAPK、P13K/AKT及相应转录因子如多药耐药基因1（MDR1）的影响，揭示蟾毒灵作为P-gp抑制剂逆转结肠癌耐药的机制，为临床治疗耐药性结肠癌提供理论依据和新的治疗策略。

多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。中药蟾酥应用于肿瘤治疗具有悠久的历史，蟾毒灵是蟾酥的主要活性成分，具有广泛的抗肿瘤活性。我们的前期研究发现，蟾毒灵具有良好的抗结肠癌作用，能够抑制裸鼠人结肠癌原位移植瘤的生长，促进肿瘤细胞凋亡，但具体的机制不清。由此，我们假设蟾毒灵可能作为一种P-gp的抑制剂，其通过克服P-gp介导的药物外排机制而增加细胞内药物的浓度，并进一步影响胞内与P-gp相联系的信号通路，诱导结肠癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长。研究结果表明，蟾毒灵能增加化疗药物对耐药细胞的敏感性，逆转结肠癌耐药，其机制涉及抑制P-gp蛋白的表达与竞争性抑制P-gp ATP酶的活性。体内实验也验证了这一结果，蟾毒灵联合阿霉素对LOVO/ADR结肠癌裸鼠移植瘤模型具有显著的抑瘤效果，能明显增加化疗药物阿霉素的疗效，且毒性评价实验表明，蟾毒灵不会增加裸鼠的体内毒性。进一步的分子机制实验证实蟾毒灵可能通过PI3K/AKT途径抑制 NF-κB的表达，减少 NF-κB的核转位，从而抑制 NF-κB 活性并干扰 MDR1 基因转录，最终导致 MDR1 mRNA及 P-gp 表达的下调，达到克服P-gp介导的结肠癌多药耐药的目的。综上所述，通过对蟾毒灵逆转结肠癌耐药分子机制的深入研究，有利于更全面地阐述蟾毒灵抗肿瘤的机制，可以有计划地联合其它化疗药物进行治疗，以取得最佳的治疗效果，达到最大限度地改善病人生存质量的目的，这对结肠癌的综合治疗、提高疗效具有重要的临床意义和应用前景。