基于SRC-3调控miR-497途径探讨蟾毒灵抗结肠癌转移的作用机制

Metastasis of colorectal cancer (mCRC) is one of main reasons of prognosis. Traditional Chinese medicine has special advantages against mCRC. Toad is used in treating mCRC by removing stasis poison spread real evil. Bufalin is an important active ingredient of Toad. Our previous study found that bufalin has good effect against mCRC, and it is related to the up-regulation of miR-497. Related literature studies show SRC-3 is one target of pleiotropic effect, which was overexpression in mCRC. Our pre-experiment showed that silencing SRC-3 can increase the expression of miR-497.Therefore, we assume that SRC-3 is involved in bufalin regulating miR-497 signal pathway to affect mCRC. Based on the assumption, this project aims to investigate the role of SRC-3 regulating miR-497 by plasmid construction, Western blot, Realtime-PCR and ChIP. Then, this project will verify this mechanism by animal experiment science technology, living imaging and pathology test in vivo, providing scientific basis for clinical application in the aspect of using bufalin to cure mCRC.

癌细胞转移是影响结肠癌预后的重要原因之一，中医药治疗具有独特的优势。蟾酥具有祛瘀攻毒散实邪之功效，临床上可配伍应用于转移性结肠癌的治疗。蟾毒灵是蟾酥的有效单体，我们前期研究发现其可以通过上调miR-497发挥抗结肠癌转移的作用，但上游分子机制不明。文献研究显示类固醇受体辅助活化因子-3（SRC-3）在结肠癌中呈高表达，且是蟾毒灵的直接作用靶点；再者，我们的预实验显示，SRC-3沉默可以上调miR-497的表达。因此，我们推测SRC-3调控miR-497可能是蟾毒灵抑制结肠癌转移的重要分子机制。基于该推测，本项目拟通过质粒构建、Western blot、实时定量PCR、免疫共沉淀等分子生物学技术在体外研究中探讨SRC-3调控miR-497途径在蟾毒灵抗结肠癌转移中的作用，进一步在体内实验中通过动物实验学技术、小动物活体成像、病理标本检测等进行验证，为临床应用蟾毒灵防治结肠癌转移提供科学依据。

癌细胞转移是影响结肠癌预后的重要原因之一，中医药治疗具有独特的优势。蟾酥具有祛瘀攻毒散实邪之功效，临床上可配伍应用于转移性结肠癌的治疗。蟾毒灵是蟾酥的有效单体，文献研究表明类固醇受体辅助活化因子-3（SRC-3）在结肠癌中呈高表达，且是蟾毒灵的直接作用靶点；我们通过细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞侵袭迁移实验等方法证实上调SRC-3可以抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭迁移；沉默SRC-3可以抑制动物原位结肠癌瘤体的增长和肝转移；双荧光素酶报告基因检测、RT-PCR、western blot等实验表明CyclinD2是miR-497直接功能性靶标，且SRC-3沉默可以上调miR-497的表达，因此SRC-3/miR-497/CyclinD2是结肠癌转移的重要分子机制。进一步研究发现，蟾毒灵可以抑制SRC-3高表达细胞的侵袭和迁移，且抑制动物模型肿瘤的增长和肝转移，但是其抑制作用与对照组相比明显减弱；蟾毒灵与miR-497协同抑制结肠癌的瘤体增长；结合上述机制研究，表明SRC-3途调控miR-497途径在蟾毒灵抑制结肠癌转移中发挥了重要作用。为推动蟾毒灵研究的成果转化，本项目做了一部分延伸研究，构建了人源性肿瘤组织异体移植模型（Patient-derived xenograft，PDX），发现蟾毒灵具有一定的抗肿瘤活性；且构建蟾毒灵水凝胶纳米制剂，发现该纳米制剂在体内外研究中均表现出优良的抗肿瘤增殖和转移活性，并具有相当的安全性，为临床应用蟾毒灵治疗转移性结肠癌提供理论依据和成果转化方向。