Annexin A5靶向造影剂介导的超声分子成像评价乳腺癌凋亡的新方法研究

It have confirmed that apoptosis pathway suppresion or deficiency is closely related to high incidence and poor prognosis of breast tumor. Clear apoptosis status is crucial to evalue targeted cancer therapy effect and set indiidualized treatment. At present, Pathology detection applies only to testing in vitro; evaluation apoptosis of nclear medicine and MRI image on Annexin A5 has not to study further because of high cost and much injures. Targeted ultrasound imaging on Annexin A5 provides new direction to solve this problem. First, we apply SDT self-control by people to solve the induction of apoptosis model dose difficult control problem. Next, we can modificate the nanoparticles surface to combind with Annexin A5 to prepare the Targeted Ultrasound Contrast Agent. In this study, we can control the SDT dose to induce cancer cell apoptosis at different levels. The features and imaging performance of the Contrast Agent will be researched in vitro and in vivo. Our goal is to explore a methd for best injection of the Contrast Agent and quantitative monitoring apoptosis and provide scientific basis for clinical tumor ultrasound molecular diagnosis of apoptosis.

已证实，凋亡通路受阻或凋亡机制缺失与乳腺肿瘤发病率高、预后差密切相关。明确凋亡状态对评价肿瘤靶向治疗效果、制定个体化治疗方案至关重要。目前，病理检测凋亡只适用于体外、磷脂结合蛋白（Annexin A5）的核医学及磁共振分子成像评价凋亡因成本高，对身体伤害大而浅尝辄止。Annexin A5分子的超声靶向成像为解决该难题提供了新方向。首先我们依据声动力学疗法（SDT）的剂量可控性优点，解决了凋亡诱导模型剂量难控制问题；再参照C.M.Lehr等方法将纳米粒子表面改性，然后与Annexin A5分子结合，进而解决了靶向造影剂制备的关键问题。本项目通过人为控制SDT治疗剂量来诱导鼠乳腺肿瘤不同程度凋亡，分别从体外细胞和活体动物水平来研究该靶向造影剂的特性、成像表现，分析其在凋亡诊断中的可行性，旨在探索该靶向造影剂活体内注射的最佳给药方式及凋亡定量监控方法，为临床肿瘤凋亡的超声分子诊断提供依据。

细胞凋亡可清除机体变异或恶性增殖细胞，已被临床研究所证实。对凋亡水平检测已成为抗癌疗效评价的一个独立指标。以Annexin V 分子为探针的超声靶向成像则为活体内无创监控肿瘤凋亡提供了新思路，为评价抗肿瘤疗效提供了新方向。.本研究首先采用薄膜水化法构建了包裹医用全氟丙烷气体的纳米级脂质微泡，首次通过生物素-亲和素系统连接Annexin V分子，得到靶向肿瘤凋亡的纳米超声造影剂（Annexin V-Nanobubbles，AV-NBs）。理化性质分析AV-NBs粒径约为640nm，且大小均匀；电镜下呈现均匀的空心球形、分散均一、稳定性好，4℃存放12h内粒径小于780 nm，24 h 内粒径仍处于纳米级，且Zeta电位呈现负性，同时AV-NBs可体外超声显影。这些特性为其顺利穿透肿瘤血管内皮，与靶细胞稳定结合、实现血池外显像创造了有利条件，达到了预期实验目的；体外细胞实验采用临床常用的化疗药顺铂，分别以95 μg/ml和135 μg/ml诱导MDA-MB-231细胞12h来构建凋亡模型进行体外结合试验，结果表明AV-NBs可与凋亡细胞膜表面PS特异结合，结合率可达80%左右，且凋亡率与结合率呈剂量依赖关系。针对小鼠活体实验，分别静脉给予荷瘤小鼠（裸鼠）1.25 mg/kg 和 2.5 mg/kg顺铂1周后，建立小鼠乳腺肿瘤不同程度凋亡模型。对小鼠通过尾静脉注射200 μl AV-NBs后，超声造影成像表明其显影效果明显、显影的持续时间较长，提示AV-NBs可实现无创靶向肿瘤凋亡成像。体外验证提示AV-NBs易富集于肿瘤组织凋亡区，肝、肾富集量少。另外，本研究发现在顺铂治疗1周后，从第4天开始移植瘤体积开始逐渐缩小，且1.25 mg/kg 和 2.5 mg/kg顺铂治疗组表现相似，而对照组的移植瘤因无药物处理，肿瘤持续增长，瘤体持续增大，该研究表明肿瘤瘤体增殖和形态变化往往晚于凋亡发生。提示凋亡检测可能是一种早期预测肿瘤病变发生变化的敏感指标，有利于肿瘤的早期诊断。.本研究首次尝试以凋亡为切入点，成功制备了靶向纳米级超声造影剂AV-NBs，弥补了体外有创检测凋亡的弊端，建立了活体内无创监控肿瘤凋亡的新方法，证实其在肿瘤凋亡的超声诊断研究中的可行性，为临床肿瘤凋亡的超声分子诊断提供了新的思路，为后期应用于临床抗癌疗效评价奠定了基础，也有利于肿瘤的早期诊断与治疗方案的调整。