家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定及功能研究

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）是丝氨酸蛋白酶活性的重要调节因子。初步研究发现，SPI在家蚕的生长发育、蜕皮变态过程具有十分重要的作用，也是家蚕的重要防御因子。针对家蚕SPI家族成员尚不清楚，具体生物学功能也不十分明了的现状，本项目拟利用家蚕全基因组，基因芯片和家蚕突变品系三大平台，在基因组水平、表达水平和生化水平上对家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂进行全面和系统的基因鉴定和功能探讨，建立家蚕SPI基因家族所有成员的结构信息、表达特征、调节机制和蛋白质产物等基础数据库。在此基础上重点研究丝腺特异表达和免疫防病相关的，具有重要理论和应用价值的SPI基因。利用分子生物学等方法，验证这些基因表达的时间和空间特征；利用蛋白质与蛋白质组学研究方法，鉴定这些基因的蛋白质产物，并通过基因干涉和转基因等方法，探讨其具体的生理功能，为阐明家蚕生长和发育、丝腺蛋白质高效合成和免疫防御等重要机理奠定基础。

本课题利用家蚕全基因组、基因芯片和家蚕突变品系三大平台，在基因组水平、表达水平和生化水平上对家蚕丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因进行了全面和系统地鉴定，共鉴定到143个丝氨酸蛋白酶基因和80个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其结构特征和时空表达模式进行了分析；同时利用大肠杆菌、黑胸败血菌、白僵菌和家蚕NPV病毒进行感染诱导家蚕，实验结果发现有18个丝氨酸蛋白酶基因和15个家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因与家蚕免疫相关；进一步在蛋白水平上对375个家蚕突变品系进行了调查，发现在家蚕血液中有9种胰蛋白酶抑制剂的分布， 在此基础上重点筛选和研究了在丝腺特异表达和免疫防病相关的具有重要理论和应用价值的4种家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能。利用分子生物学等方法，验证这些基因表达的时间和空间特征，利用蛋白质与蛋白质组学研究方法，鉴定了这些基因的蛋白质产物，并验证了其具体的生理功能。研究结果表明丝腺特异表达基因BmSPI16和 BmSPI18通过抑制5龄第7天中部丝腺前区分泌的蛋白酶从而保护贮存在中部丝腺的丝蛋白不被降解，而BmSPI37可能在细菌和真菌等病原微生物的入侵中对茧壳起重要保护作用。免疫相关基因BmSPI38不仅可以强烈抑制昆虫致病性真菌分泌的蛋白酶，而且能够阻断球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶CDEP-1诱导的黑化反应。本课题共发表论文16篇，其中SCI论文6篇，申请专利2项。这些结果为阐明家蚕生长和发育以及丝腺蛋白质高效合成和免疫防御等重要机理奠定了基础，同时也将为人类真菌病治疗及农业害虫控制提供理论参考。